尹程程，楊 洋，趙大慶，陳昊媛，張 旭，范莎莎，齊 濱*，睢博文*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春130117； 2.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117）

北五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實，具有益氣生津、收斂固澀、補腎寧心等功效［1］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種功效，對肝損傷、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤、糖尿病等均有不同程度治療作用［2?10］，主要含有木脂素類、多糖類、揮發(fā)油類［11］。中藥有效成分的含量與飲片質(zhì)量之間存在一定相關(guān)性［12］，為保證中藥臨床療效，對其質(zhì)量控制至關(guān)重要。北五味子為吉林省珍貴道地藥材，由于市場行情波動較大，導(dǎo)致出現(xiàn)以次充好、“搶青”等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了其臨床藥效。

《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》 及《中藥材商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)匯編》 均記載北五味子“呈不規(guī)則球形或橢圓形，皺縮，內(nèi)有腎形種子1～2 粒。果肉微酸，種子有香氣，味辛微苦?！辈⒏鶕?jù)顏色、有無白霜、干癟粒重對北五味子進行等級劃分，但對于有白霜顏色鮮紅者或無白霜顏色暗紅者無法準(zhǔn)確劃分等級，并且等級劃分忽略了有效成分對其的影響。本研究收集北五味子，并探討外在指標(biāo)與內(nèi)在含量直接關(guān)聯(lián)，以期為建立該藥材等級劃分體系提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LC?2030 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ5200 型臺式超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）；ST?40R 型高速冷凍離心機（美國賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 藥物與試劑 對照品五味子醇甲（批號DST191010?010）、五味子醇乙（批號DST190807?013）、五味子甲素（批號DST190908?008）、五味子乙素（批號DST190819?009），純度均≥98%，購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈［色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；水為屈臣氏水。

1.3 飲片 北五味子飲片從不同產(chǎn)地收集而來，信息見表1，均由長春中醫(yī)藥大學(xué)肖井雷副教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 Vision HT C18HL 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相乙腈（A）?水（B），梯度洗脫（0～40 min，45%～55%A；40～55 min，55%～61%A；55～75 min，61%～70%A）；體積流量0.8 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長250 nm。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品五味子醇甲9.71 mg、五味子醇乙2.66 mg、五味子甲素2.28 mg、五味子乙素6.42 mg，置于量瓶中，甲醇定容至10 mL，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取北五味子粉末，過3號篩，精密稱取0.25 g，加入25 mL 正己烷，稱定質(zhì)量，超聲（250 W、50 kHz）處理30 min，正己烷補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液10 μL，在“2.1.1”項條件下連續(xù)進樣6 次，得出五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積RSD 分別為1.65%、1.70%、1.57%、1.86%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 精密稱取北五味子6 份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項條件下于0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，得出五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積RSD 分別為1.25%、0.39%、0.54%、0.47%，表明溶液在24 h 穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 精密稱取北五味子6 份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項條件下進樣，得出五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積RSD 分別為0.96%、1.10%、0.63%、0.19%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液 0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL，甲醇稀釋定容至5 mL，分別吸取10 μL，在“2.1.1”項條件下檢測。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行回歸，結(jié)果見表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.1.8 加樣回收率試驗 取北五味子（樣品1）飲片粉末0.25 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，加入各對照品適量（五味子醇乙0.266 mg、五味子醇甲0.971 mg、五味子甲素0.228 mg、五味子乙素0.642 mg），混勻，在“2.1.1”項條件下檢測，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.1.9 樣品含量測定 取樣品（1～50 號）各0.25 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液。各取10 μL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣，色譜圖見圖1，再計算含量，結(jié)果見表4。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 外觀性狀參數(shù)篩選 參考《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》 及《中藥材商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)匯編》中劃分北五味子等級的外觀性狀指標(biāo)，結(jié)合2020年版《中國藥典》 對北五味子性狀的描述，選擇干癟粒質(zhì)量占比作為指標(biāo)進行測定。

2.3 內(nèi)在質(zhì)量參數(shù)篩選 北五味子藥理活性主要與其木脂素類成分有關(guān)，占比2%～8%，已鑒定出來的多達31 種［13?14］。其中，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素含量較高，藥理活性廣泛，并且五味子醇甲為2020 年版《中國藥典》 中北五味子含量測定項，因此本實驗在進行等級研究時選擇藥理活性廣泛、含量高的成分作為指標(biāo)，同時參照2020 年版《中國藥典》 測定北五味子雜質(zhì)（通則2301）、水分（通則0832 第二法）、總灰分（通則2302），結(jié)果見表4。

表4 各樣品內(nèi)在指標(biāo)測定結(jié)果（%）Tab.4 Measurement results for internal indices of various samples（%）

2.4 相關(guān)性分析 采用SPSS 軟件，對影響北五味子外觀性狀、內(nèi)在指標(biāo)的干癟質(zhì)量占比、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、雜質(zhì)、水分、總灰分、酸不溶性灰分進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表5。北五味子干癟粒質(zhì)量占比與北五味子五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素及四種木脂素含量之和均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），并且均呈負(fù)相關(guān)；干癟粒質(zhì)量占比與五味子醇甲、五味子乙素呈強相關(guān)性，與五味子醇乙、五味子甲素呈一般相關(guān)性。

表5 Person 相關(guān)性分析結(jié)果Tab.5 Results of Pearson correlation analysis

2.5 主成分分析 主成分分析是一種能夠通過采用降維和因子分析，將多個變量轉(zhuǎn)化為較少的變量來獲取原始數(shù)據(jù)中的大部分變異的統(tǒng)計學(xué)方法［15?17］。采用SPSS 22.0 軟件對影響北五味子質(zhì)量的相關(guān)指標(biāo)進行分析，結(jié)果見表6，提取特征值＞0.5 的主成分，可得到3 個，見表7，分別對應(yīng)因子1、因子2、因子3，累積貢獻率可達95.12%。

表6 主成分初始特征值和貢獻率Tab.6 Initial eigenvalues and contribution rates of principal components

表7 主成分矩陣與特征向量Tab.7 Principal components’ matrices and feature vectors

根據(jù)特征向量及累積貢獻率建立主成分分析模型，具體如下。

F ＝59.367%F1＋20.901%F2＋14.852%F3；

F1＝0.504X1＋0.271X2＋0.418X3＋0.455X4＋0.526X5－0.118X6；

F2＝－0.096X1＋0.651X2－0.456X3＋0.316X4－0.040X5＋0.506X6；

F3＝0.064X1－0.445X2＋0.303X3＋0.044X4＋0.077X5＋0.836X6。

其中，X1、X2、X3、X4、X5、X6分別表示五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、4 種木脂素之和、干癟粒質(zhì)量占比這6 個原始變量標(biāo)準(zhǔn)化后的變量，F(xiàn)1、F2、F3表示3 個主成分的得分。以主成分貢獻率對主成分得分進行加權(quán)平均得綜合評分F，并按照模型進行評分，將得分大于0 者劃分為一等，小于0 者劃分為二等，對比市場分級方式（購買信息）、傳統(tǒng)分級方式與模型分級方式，結(jié)果見表8。傳統(tǒng)分級方式能夠?qū)Υ蟛糠直蔽逦蹲由唐凤嬈M行很好的等級劃分，但仍有樣品難以判斷其等級；模型分級方式可較為直觀反映各產(chǎn)地北五味子質(zhì)量情況，并且分級情況與商品本身所提供的等級基本一致。

表8 五味子市場、傳統(tǒng)、模型分級比較Tab.8 Comparisons of Schisandra chinensis grades of market，tradition and model

2.6 正交偏最小二乘判別法分析（OPLS?DA）為進一步觀察50 批樣品差異，采用有監(jiān)督模式的正交偏最小二乘判別法分析，見圖2，各批樣品經(jīng)等級劃分后具有很好的分離趨勢，表明該模型的建立能根據(jù)質(zhì)量對北五味子進行分類。如圖3 所示，6 個指標(biāo)對北五味子質(zhì)量影響大小依次為干癟粒質(zhì)量占比＞4 種木質(zhì)素之和＞五味子醇甲＞五味子甲素＞五味子乙素＞五味子醇乙。

圖2 各樣品OPLS?DA 得分散點圖Fig.2 OPLS?DA score scatter plot of various samples

圖3 變量重要性投影圖Fig.3 Variable importance projection

2.7 質(zhì)量等級劃分 以有效成分含量為內(nèi)在指標(biāo)，干癟粒質(zhì)量占比為外在指標(biāo)，采用主成分分析模型綜合多個指標(biāo)進行標(biāo)準(zhǔn)量化，結(jié)果見表8。最終，以五味子醇甲含量符合2020 年版《中國藥典》 要求，即不低于0.4%、顏色紅、無白霜、模型評分大于0 者為一等品；符合2020 年版《中國藥典》要求，即顏色暗紅、有或無白霜、模型評分小于0者為二等品，評分越高，表明飲片質(zhì)量越好。

3 討論與結(jié)論

北五味子以粒大、飽滿為優(yōu)，參考《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》 《中藥材商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)匯編》 以及2020 年版《中國藥典》 中對北五味子商品飲片的等級劃分項，常以顏色、有無白霜、干癟粒進行分級。但其中不乏其他大小不一的五味子混入。北五味子主要藥效成分為木脂素類成分，同時富含有機酸［18］、萜類揮發(fā)油、多糖類成分，其中多糖類成分含量達85.56%［19］，揮發(fā)油含量可達12.2 mL／kg［20］。在儲存過程中，豐富的揮發(fā)油及多糖類成分常導(dǎo)致北五味子飲片，出現(xiàn)油脂外溢、質(zhì)地返軟、發(fā)黏、顏色變深、氣味散失等現(xiàn)象。這也使得不法商人以“搶青”貨充當(dāng)成熟北五味子的事時有發(fā)生。北五味子在長期儲存過程中表面有結(jié)晶類物質(zhì)析出，稱“白霜”或“析霜”。

僅以色澤、有無白霜并不能完全代表其質(zhì)量優(yōu)劣，儲存環(huán)境對北五味子外觀性狀的影響也可能是導(dǎo)致傳統(tǒng)分級方式無法對某些批進行準(zhǔn)確等級劃分的原因。本研究等級劃分模型建立時，由于顏色及有無白霜無法進行量化，綜合考慮各參考文獻所提及影響指標(biāo)，采用可量化的且與質(zhì)量相關(guān)的外觀性狀指標(biāo)（干癟粒質(zhì)量），通過數(shù)學(xué)模型對北五味子各質(zhì)量相關(guān)指標(biāo)進行標(biāo)準(zhǔn)化，以評分形式對商品飲片等級進行劃分。建立了能夠快速、準(zhǔn)確的對所購北五味子進行等級劃分的方法。

綜上所述，本實驗收集50 批來源于不同道地產(chǎn)地的北五味子，以內(nèi)在指標(biāo)與外觀性狀指標(biāo)建立等級劃分?jǐn)?shù)學(xué)評分模型，并結(jié)合不可量化的顏色、有無白霜等性狀指標(biāo)，建立較為全面的北五味子質(zhì)量等級劃分模式。