楊欣欣 張云坤王 帥 李天嬌包永睿*孟憲生

（1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連116600； 2.遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連116600； 3.大連醫(yī)科大學附屬二院，遼寧 大連 116023）

路路通為金縷梅科植物楓香樹Liquidambar formosanaHance 的干燥成熟果序，性味苦、平，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風活絡(luò)、利水、通經(jīng)的功效［1］，生長于平原及丘陵地帶，分布于我國華東、華南、西南等地，現(xiàn)代藥理研究表明，其有保肝、抗腫瘤、抑制關(guān)節(jié)炎腫脹、消炎等作用［2］。研究發(fā)現(xiàn)，路路通藥材中單體成分路路通酸對卵巢癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤具有良好的抑制作用［3?5］。但中藥是多組分、多靶點綜合作用的整體，其藥效應由多種藥效成分共同作用的結(jié)果［6］。路路通主要有揮發(fā)油、萜類、內(nèi)酯類、黃酮類、有機酸及糖類等成分，其中揮發(fā)油、三萜類含量最為豐富［7］。探討活性部位與抗腫瘤藥效程度之間的關(guān)聯(lián)性，明確路路通抗腫瘤的藥效物質(zhì)，將成為路路通藥材在治療腫瘤方面應用開發(fā)的關(guān)鍵科學問題。

本實驗在明確路路通藥材抗腫瘤藥效部位為乙酸乙酯提取物的基礎(chǔ)上，采用HPLC 法建立不同產(chǎn)地路路通藥材指紋圖譜［8］，采用人肝癌SMMC?7721 細胞體外模型開展不同產(chǎn)地路路通抗肝腫瘤藥理藥效研究；運用灰色關(guān)聯(lián)及偏最小二乘分析法，將指紋圖譜與藥效進行關(guān)聯(lián)，獲得對藥效功效較大的色譜峰。同時，采用UPLC?QTOF?MS 技術(shù)，對其乙酸乙酯藥效部位的質(zhì)譜峰與HPLC 法獲得的色譜峰進行比對，明確色譜峰的精準分子量，找到在質(zhì)譜及色譜中表達較高、色譜分離度較好的共有峰，開展譜效關(guān)系研究，并對其部分藥效成分進行解析，以期待篩選出路路通抗腫瘤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為其后期深度開發(fā)和臨床應用提供前期實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 1290 型超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Tecan sunrise 型酶標儀（瑞士帝肯公司）；US AUTOFLOW 型CO2培養(yǎng)箱（德國Nuaire公司）；E31 型倒置相差顯微鏡（Motic 公司）。

1.2 試劑與藥物 人肝癌細胞株SMMC?7721（武漢博士德生物工程有限公司）。11 批路路通購自安國市啟美藥材有限公司，由遼寧中醫(yī)藥大學中藥植物教研室許亮教授植物鑒定為金縷梅科植物楓香樹Liquidambar formosanaHance 的干燥成熟果序，產(chǎn)地與編號分別為S1 江蘇謫氏、S2 河北保定、S3 江蘇祝文忠中醫(yī)、S4 江蘇民樂秦皇島、S5 江蘇成大方圓、S6 江蘇祁一、S7 河北鼎辰、S8 河北安國鴻翔、S9 湖南裕寶堂、S10 江蘇唐人、S11 四川。

1.3 樣品制備

1.3.1 乙酸乙酯提取物 精密稱取不同產(chǎn)地藥材粗粉約100 g，置于具塞錐形瓶中，加入1 000 mL乙酸乙酯溶液，加熱回流1 h，放冷，抽濾，揮干，即得。

1.3.2 供試品溶液 稱取乙酸乙酯提取物約0.5 g，精密稱定，置于25 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，冷卻后補足減失質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

1.3.3 含藥培養(yǎng)液制備 稱取乙酸乙酯提取物適量，加三級水（0.3% DMSO 助溶）制成質(zhì)量濃度為2 mg／mL 的溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得，用于后期體外藥效評價研究。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件 Agilent poroshell 120 色譜柱（50 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動相0.1% 甲酸（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，5% B；10～110 min，5%～80% B）；體積流量0.8 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL；檢測波長254 nm。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正、負離子模式測定；毛細管電壓3 800 V；干燥氣體體積流量10 L／min，溫度280 ℃；霧化器壓力45 psi（1 psi＝6.895 kPa）；鞘氣溫度350 ℃，體積流量12 L／min；碎裂電壓150 V；質(zhì)量范圍m／z50～1 200。

2.1.3 精密度試驗 精密吸取8 號供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6 次，測得各色譜峰相對保留時間RSD 在0.29%～0.57%之間，相對峰面積RSD 在1.36%～2.76% 之間，均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 制備8 號樣品供試品溶液1份，于室溫放置0、3、6、12、24、48 h 后 在“2.1.1”項色譜條件下進樣，測得各色譜峰相對保留時間RSD 在0.21%～0.47%之間，相對峰面積RSD 在2.07%～3.49%之間，均小于5%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 重復性試驗 制備8 號樣品的供試品溶液6 份，在“2.1.1”項色譜條件下進樣，測得各色譜峰相對保留時間RSD 在0.65%～1.36%之間，相對峰面積RSD 在2.96%～3.42%之間，均小于5%，表明該方法重復性良好。

2.1.6 指紋圖譜建立 精密吸取11 批供試品溶液各2 μL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣，指紋圖譜見圖1，對照圖譜見圖2。

圖1 11 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of eleven batches of samples

圖2 不同產(chǎn)地樣品乙酸乙酯提取物對照圖譜Fig.2 Reference map for ethyl acetate extract of samples from different areas

在對不同儀器類型、色譜柱等指紋圖譜適用性考察的基礎(chǔ)上構(gòu)建了指紋圖譜，從中篩選出27 個主要色譜峰，得出其保留時間與峰面積，用于下一步譜效分析。

2.2 對人肝癌SMMC?7721 細胞的抑制作用 取培養(yǎng)2～3 d、處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的人肝癌SMMC?7721 細胞，1×PBS 清洗2 次，每次1 mL，1 mL 的胰蛋白酶消化，待細胞趨于變圓后培養(yǎng)液終止消化，并沖洗吹打制成細胞懸液，于細胞計數(shù)板上計數(shù)，加培養(yǎng)液稀釋至濃度為5×104／mL，接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)約12 h待細胞貼壁完全。設(shè)加藥試驗孔、空白對照孔（加細胞不加藥物），每組5 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔避光加20 μL MTT（5 mg／mL），繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后吸凈孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO，搖床振搖10 min，用酶標儀在492 nm 處掃描，測定光密度（OD）［9?12］，結(jié)果見表1。

表1 不同產(chǎn)地樣品乙酸乙酯提取物對人肝癌SMMC?7721 細胞的抑制率（， n＝3）Tab.1 Inhibitory effects of ethyl acetate extract of samples from different growing areas on human hepatocarcinoma SMMC?7721 cells（， n＝3）

表1 不同產(chǎn)地樣品乙酸乙酯提取物對人肝癌SMMC?7721 細胞的抑制率（， n＝3）Tab.1 Inhibitory effects of ethyl acetate extract of samples from different growing areas on human hepatocarcinoma SMMC?7721 cells（， n＝3）

2.3 灰色關(guān)聯(lián)度分析 先將影響整體行為的數(shù)據(jù)進行分列，以反映系統(tǒng)藥效行為特征的數(shù)據(jù)序列（細胞的抑制率）為參考數(shù)列，即母序列；以影響系統(tǒng)藥效行為的因素數(shù)據(jù)序列（不同產(chǎn)地路路通藥材的不同峰面積經(jīng)歸一化處理后）為比較數(shù)列，即子系列。采用灰色關(guān)聯(lián)度分析軟件（Grey ModeLing_ V3.0）進行分析，得出不同極性藥材色譜峰與體外藥效學評價指標之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)［13?16］，見表2。

由此可知，這27 個主要色譜峰代表的化學成分對肝癌抑制作用有一定的差異性，其中相關(guān)系數(shù)大于0.7 的色譜峰為1、2、4、5、6、8、12、13、16、17、18、19、20、21、24、25、26 號，相關(guān)度依次為16th＞19th＞8th＞13th＞2th＞6th＞21th＞26th＞5th＞18th＞24th＞20th＞17th＞12th＞1th＞4th＞25th。

2.4 偏最小二乘回歸分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件，以歸一化后的27 個主要色譜峰為自變量（X），藥效數(shù)據(jù)為因變量（Y）進行偏最小二乘回歸分析，結(jié)果見表3?；貧w方程為Y＝4.602 ＋0.068X1＋0.112X2＋0.063X3＋0.073X4－0.652X5－0.144X6－0.064X7－0.539X8－0.146X9－0.005X10－0.113X11＋0.023X12－0.460X13＋0.142X14－0.026X15＋0.013X16－0.226X17－0.155X18＋0.423X19－0.039X20＋0.054X21－0.045X22－0.020X23－0.021X24＋0.164X25＋0.429X26＋0.136X27。

表3 系數(shù)估計、累積變量重要性結(jié)果Tab.3 Results of coefficient estimation and cumulative variable importance

綜合累積變量重要性結(jié)果，可見1、2、3、4、12、14、16、19、21、25、26、27 對藥效貢獻較大，起到正向促進作用。與灰色關(guān)聯(lián)度分析比較，共有9 個色譜峰一致，相似度為75%。

2.5 HPLC?Q?TOF／MS 分析運 用 Agilent MassHunter Qualitative Analysis 軟件對質(zhì)譜圖進行分析，尋找各個質(zhì)譜峰所對應的分子量，推測分子式，找出質(zhì)譜峰可能對應的化合物，并參考文獻報道的化合物精準分子量，初步確定色譜峰對應的化合物，結(jié)果見表4。

表4 各樣品乙酸乙酯提取物中化合物鑒定結(jié)果Tab.4 Identification results for compounds in ethyl acetate extract of various samples

3 討論與結(jié)論

《黃帝內(nèi)經(jīng)》 認為，腫瘤是長期經(jīng)絡(luò)氣血積聚、瘀滯導致邪阻絡(luò)脈所致的結(jié)果，符合久痛入絡(luò)、久病入絡(luò)的發(fā)病機制［17］?，F(xiàn)代中醫(yī)也認為，經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)與腫瘤病證發(fā)生發(fā)展及病證治療有著極為密切的聯(lián)系［18］。路路通果體多孔，歸肝、腎經(jīng)，有通行十二經(jīng)之功效，為通經(jīng)活絡(luò)的常用中藥。從中醫(yī)治療腫瘤的理論入手，找到路路通中抗腫瘤的活性單體，以期為疏經(jīng)通絡(luò)理論闡釋及中藥抗腫瘤研究提供參考。

本研究在前期路路通抗肝腫瘤藥效物質(zhì)確定的基礎(chǔ)上，圍繞活性部位抗腫瘤藥效單體篩選這一科學問題，采用灰關(guān)分析、偏最小二乘回歸2 種分析，獲得了路路通抗腫瘤活性較強的1、2、4、12、16、19、21、25、26 號共9 個色譜峰，2 種分析方法相似性為75%，實驗結(jié)果表明了2 種分析方法用于篩選藥效成分的合理性。分析2 種方法結(jié)果差異性的由來，可能與灰關(guān)分析方法僅僅標識成分對藥效的貢獻，但不表示其正促進或是負抑制，而偏最小二乘回歸分析方法獲得是正促進的藥效成分。

本課題組下一步將圍繞藥效單體成分定性、定量，藥理藥效評價，成分配伍及優(yōu)化開展研究，期待較為全面的獲得路路通藥材抗肝腫瘤的藥效物質(zhì)，以期為其抗腫瘤藥物研發(fā)、臨床應用及作用機制研究奠定基礎(chǔ)。