喬麗婭胡鳳云沈 卓黃寶優(yōu)夏祥華 張占江*

（1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧530023； 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東 廣州510640； 3.中國(guó)科學(xué)院高能物理研究所，北京 100049）

兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.為蕓香科花椒屬木質(zhì)藤本植物，根部入藥［1］，主要分布于我國(guó)兩廣、貴州、云南、福建等亞熱帶季風(fēng)氣候地區(qū)［2］，富含多種生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)等活性成分［3］，具有抗炎、抗氧化、抗癌、保護(hù)心血管系統(tǒng)等作用［4?6］。雖然對(duì)兩面針成分分析已有報(bào)道［7?9］，但主流的HPLC 法需要所有成分作為對(duì)照品，而鹽酸血根堿、白屈菜紅堿、橙皮苷、木蘭花堿分離純化難度大，不易獲得，對(duì)照品價(jià)格昂貴，從而限制了該方法在實(shí)際生產(chǎn)和檢測(cè)中的應(yīng)用。

一測(cè)多評(píng)法［10?11］是利用中藥有效成分之間的外標(biāo)內(nèi)在函數(shù)和比例關(guān)系，通過(guò)測(cè)定一種成分而實(shí)現(xiàn)多種成分的同步測(cè)定，具有成本低、方法簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在中藥材多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)中具有一定的優(yōu)勢(shì)［11?12］。本實(shí)驗(yàn)采用該方法，以含量高、便宜易得的氯化兩面針堿為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算其他4 種成分的相對(duì)校正因子，測(cè)定其含量，以期為該藥材質(zhì)量控制提供新思路。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity 型高效液相色譜儀（四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、柱溫箱，美國(guó)安捷倫公司）；Cary 50 型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Varian 公司）；KQ5200E 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；CP225D 型電子分析天平（十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius 公司）。

1.2 試劑 鹽酸血根堿（批號(hào)510001?201101，純度99.3%）、氯化兩面針堿（批號(hào)110848?200603，純度99.2%）、白屈菜紅堿（批號(hào)111718?201402，純度80.5%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)160406，純度98.0%）購(gòu)自北京博藝匯科生物技術(shù)有限公司；木蘭花堿對(duì)照品（批號(hào)P11A10L85442，純度98.0%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 藥材 12 批兩面針經(jīng)廣西藥用植物園標(biāo)本館黃寶優(yōu)高級(jí)工程師鑒定為兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.的根，信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相20%乙腈? 0.1%甲酸（三乙胺調(diào)節(jié)pH 至4.5）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)273、284 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取各對(duì)照品適量，70%甲醇溶解并定容至25 mL，制成不同質(zhì)量濃度貯備液（氯化兩面針堿0.045 6 mg／mL、木蘭花堿0.193 3 mg／mL、橙皮苷0.195 6 mg／mL、鹽酸血根堿0.050 0 mg／mL、白屈菜紅堿0.147 2 mg／mL），置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。精密量? mL，70%甲醇定容至2、5、10、25 mL，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱(chēng)定樣品粉末（粒徑≤0.5 mm）1.0 g，置于具塞錐形瓶中，70%甲醇超聲提取30 min，重復(fù)3 次（料液比1 ∶6），合并提取液，乙醇定容至50 mL 量瓶中，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性考察 吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此表明，理論塔板數(shù)以木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿峰計(jì)，分別為23 611、27 270、20 760、41 923、50 087，分離度均大于1.5，各基線分離良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣5 次，測(cè)得木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿峰面積RSD 分別為0.45%、0.21%、0.63%、0.33%、0.29%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿峰面積RSD 分別為1.29%、0.98%、1.27%、1.08%、0.83%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批供試品（Z2）粉末6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿含量RSD 分別為1.48%、2.24%、1.43%、1.32%、2.36%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批供試品（Z2），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

2.5 一測(cè)多評(píng)

2.5.1 相對(duì)校正因子計(jì)算 采用多點(diǎn)校正法計(jì)算相對(duì)校正因子（fx／c）［13］，取平均值，公式為fx／c＝fx／fc＝（Mc×Ax）／（Mx×Ac），其中Mc為內(nèi)參物質(zhì)量濃度，Ax為待測(cè)組分的峰面積，Mx為待測(cè)組分的質(zhì)量，Ac為內(nèi)參物峰面積。吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，由于氯化兩面針堿較易獲得，價(jià)格低廉，而且在樣品中的含量較高，故選擇其作為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的fx／c，結(jié)果見(jiàn)表4，表明均有良好的重復(fù)性。

表4 各成分相對(duì)校正因子Tab.4 Relative correlation factors of various constituents

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 選擇Shimadzu WondaCract ODS?2、Tianhe Kromasil C18、Phenomenex Luna C18、Dalian Elite hypersil BDS C18、Agilent Zorbax SB?aq C18色譜柱，計(jì)算相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表5，可知該方法能滿(mǎn)足定量分析要求。

表5 不同色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.5 Effects of different columns on relative correction factors

2.6 含量測(cè)定結(jié)果比較 精密稱(chēng)取12 批樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表6，通過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn)［13］分析其差值，發(fā)現(xiàn)2 種方法下各成分含量均無(wú)明顯差異。

表6 一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法所得結(jié)果比較（mg／g）Tab.6 Comparison of results obtained by QAMS method and external standard method（mg／g）

3 討論

2015 年版《中國(guó)藥典》 中，兩面針質(zhì)量評(píng)價(jià)只測(cè)定了氯化兩面針堿含量。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［14?15］ 測(cè)定5 種成分含量，可用于該藥材質(zhì)量控制。

參照2015 年版《中國(guó)藥典》 氯化兩面針堿的測(cè)定方法，分別以不同體積比例的乙醇和甲醇為提取溶劑。結(jié)果表明，70%甲醇、無(wú)水甲醇中提取效率較高，由于前者成本更低，因此選用其作為提取溶劑。

比較甲醇?0.1%甲酸、甲醇?0.1%甲酸?三乙胺（pH 4.5）、乙腈?0.1%甲酸、乙腈?0.1%甲酸?三乙胺（pH 4.5），發(fā)現(xiàn)乙腈?0.1% 甲酸、乙腈?0.1%甲酸?三乙胺（pH 4.5）作為流動(dòng)相時(shí)供試品峰形較好。由于三乙胺與SiO－作用力更強(qiáng)，可降低生物堿吸附，抑制峰拖尾，減少損傷色譜柱，故最終以乙腈?0.1%甲酸?三乙胺（pH 4.5）為流動(dòng)相。

采用二極管陣列PDA 檢測(cè)器對(duì)5 種成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析，結(jié)果表明木蘭花堿、橙皮苷的最大吸收波長(zhǎng)在284 nm 處，而鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿在273 nm處。

本研究分別采用一測(cè)多評(píng)和外標(biāo)法對(duì)12 個(gè)產(chǎn)地的兩面針進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)所得結(jié)果的相對(duì)偏差均小于3%，證明一測(cè)多評(píng)法能準(zhǔn)確測(cè)定該藥材中5 種成分的含量。