盧汝梅，張進(jìn)燕，王 肖，楊新洲，韋建華，李 兵*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧530200； 2.中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430074）

壯藥龍骨風(fēng)為桫欏科植物桫欏Alsophila spinulosa（Wall.ex Hook.）Tryon 的莖干，具有祛風(fēng)除濕、活血散瘀、清熱解毒、止咳平喘、強(qiáng)筋骨、殺蟲等功效［1?2］，主要分布在中國(guó)南部、南亞和東南亞等地［3?4］，具有一定的抗腫瘤、抗菌和鎮(zhèn)痛作用［5?7］，主要含黃酮、三萜、甾體、酚酸等成分［8?12］。藥材中化學(xué)成分種類及含量可能會(huì)隨著其地理來(lái)源、物種和收獲季節(jié)的不同而產(chǎn)生變化［13?14］。龍骨風(fēng)來(lái)源廣泛，規(guī)格等級(jí)復(fù)雜，僅憑TLC 或單一成分含量測(cè)定難以全面反映其質(zhì)量。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者采用指紋圖譜結(jié)合多成分定量分析的方法進(jìn)行藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)［15?18］，故本實(shí)驗(yàn)建立11 批龍骨風(fēng)HPLC 指紋圖譜，并對(duì)其中5 種成分含量進(jìn)行測(cè)定，以期為其科學(xué)鑒定和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；UV?1780 型紫外分光光度計(jì)［島津（中國(guó)）有限公司］；CPA225D 型電子天平［十萬(wàn)分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；KQ5200B型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

甲醇為色譜純［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；其他試劑均為分析純；水為超純水。原兒茶酸（批號(hào)110809?201205）、原兒茶醛（批號(hào)110810?201608）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；其余對(duì)照品為2018 年廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)課題組從龍骨風(fēng)中分離得到，分別為咖啡酸、反式對(duì)羥基肉桂酸、阿魏酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98.0%。

11 批龍骨風(fēng)采自國(guó)外內(nèi)各地，信息見(jiàn)表1，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥學(xué)院韋松基教授鑒定為桫欏科植物桫欏Alsophila spinulosa（Wall.ex Hook.）Tryon 的莖干。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條 件 COSMOSIL 5C18?PAQ 色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）?0.1%磷酸（B），梯度洗脫，程序見(jiàn)表2；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量15 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，置于2 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容，制得貯備液，取適量置于同一量瓶中，加甲醇稀釋，制成分別含原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、反式對(duì)羥基肉桂酸、阿魏酸0.187 9、0.371 0、0.170 4、0.023 5、0.019 8 mg／mL 的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取龍骨風(fēng)粉末（50 目）5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇?1%冰醋酸（70 ∶30）混合液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲45 min，放冷，甲醇?1%冰醋酸（70 ∶30）混合液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，揮干溶劑，甲醇?1%冰醋酸（70 ∶30）定容至5 mL，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取藥材（LGF20170428），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6 次，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD 均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取藥材（LGF20170428），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、8、12、16、24 h 測(cè)定，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD 均小于3.0%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材（LGF20170428），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積RSD 均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜建立 取11 批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。

2.4.1 共有峰確定 根據(jù)11 批樣品HPLC 色譜圖，并比對(duì)15 個(gè)共有峰，構(gòu)建其特征指紋圖譜。由于原兒茶醛在各批樣品中均出現(xiàn)，分離度良好，峰面積較大，故選擇其（5 號(hào)峰）作為參照峰。

2.4.2 共有峰歸屬 通過(guò)對(duì)照品比對(duì)，確定5 個(gè)共有峰代表的成分，其中4～5 號(hào)峰分別確定為原兒茶酸、原兒茶醛，9 號(hào)峰為咖啡酸，11 號(hào)峰為反式對(duì)羥基肉桂酸，15 號(hào)峰為阿魏酸，見(jiàn)圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.3 相似度計(jì)算及對(duì)照指紋圖譜生成 11 批樣品指紋圖譜見(jiàn)圖2，將其AIA 數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)研究版（2012）進(jìn)行相似度計(jì)算，設(shè)置樣品S1 圖譜為參照?qǐng)D譜，對(duì)照?qǐng)D譜生成方法采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1，自動(dòng)匹配，生成對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖3，相似度見(jiàn)表3。

圖2 11 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of eleven batches of samples

圖3 11 批樣品HPLC 指紋圖譜共有模式Fig.3 Common pattern of HPLC fingerprints of eleven batches of samples

表3 11 批樣品相似度Tab.3 Similarities of eleven batches of samples

2.4.4 相似度分析 與對(duì)照指紋圖譜比較，各批樣品相似度在0.829～0.948 之間，90.9%在0.850以上，表明不同產(chǎn)地藥材成分相似度高，但仍然存在一定差異。另外，S4、S1、S5、S11、S9、S10相似度較低，其他樣品較高，其中S10 與共有模式圖譜的相似度最低，僅為0.829。

2.4.5 聚類分析 運(yùn)用SPSS Statistics 22.0 軟件對(duì)11 批樣品的共有峰面積進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用組間連接法，以平方Euclidean 距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)化范圍0～1，結(jié)果見(jiàn)圖4。在距離10 內(nèi)，11批樣品聚為3 類；樣品S1～S5、S8、S11 產(chǎn)地、共有峰面積相近，因此聚為一類；S6～S7、S9 聚為一類；S10 的差異性最大，聚類距離最遠(yuǎn)，聚為一類，與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致。

圖4 11 批樣品聚類樹狀圖Fig.4 Dendrogram of eleven batches of samples

2.4.6 主成分分析 在聚類分析的基礎(chǔ)上，運(yùn)用SPSS Statistics 22.0 對(duì)樣品進(jìn)行主成分分析，主成分的特征值及貢獻(xiàn)率作為主成分選擇的依據(jù)。根據(jù)降維結(jié)果，共挑選出2 個(gè)主成分因子，各主成分因子方差貢獻(xiàn)值分別為81.869%、8.253%，累積貢獻(xiàn)值達(dá)到90.122%，見(jiàn)圖5，與聚類分析的結(jié)果一致。

圖5 11 批樣品主成分分析圖Fig.5 Principal component analysis plot for eleven batches of samples

2.5 5 種成分含量測(cè)定

2.5.1 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品貯備液適量，逐級(jí)稀釋，制成對(duì)照品溶液，分別精密吸取15 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，發(fā)現(xiàn)各成分均呈良好的線性關(guān)系，見(jiàn)表4。

表4 各成分線性關(guān)系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取藥材（LGF20170428）粉末5 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6 次，測(cè)得原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、反式對(duì)羥基肉桂酸、阿魏酸峰面積RSD 分別為0.72%、0.52%、0.53%、0.40%、0.21%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取藥材（LGF20170428）粉末5 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，于0、2、4、6、8、12、24 h 各精密吸取15.0 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、反式對(duì)羥基肉桂酸、阿魏酸峰面積RSD 分別為1.55%、1.28%、0.97%、0.60%、0.31%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材（LGF20170428）粉末5 g，精密稱定6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各吸取15.0 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、反式對(duì)羥基肉桂酸、阿魏酸峰面積RSD 分別為0.27%、0.32%、0.74%、0.63%、0.32%，表 明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取藥材（LGF20170428）粉末2.5 g，共6 份，精密加入含原兒茶酸（0.177 mg／mL）、原兒茶醛（0.410 mg／mL）、咖啡酸（0.511 mg／mL）、反式對(duì)羥基肉桂酸（0.061 mg／mL）、阿魏酸（0.147 mg／mL）的對(duì)照品溶液1.00 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣15 μL，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.5 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.5.6 樣品含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地藥材各5 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，精密吸取15.0 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g）Tab.6 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)不同提取方法、溶劑種類、提取次數(shù)、提取體積、流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜柱、柱溫、流速等條件進(jìn)行考察。結(jié)果表明，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣時(shí)，所得色譜圖峰形較好、分離度高，重復(fù)性好，因此選擇其作為色譜條件。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用HPLC 法建立了11 批樣品的指紋圖譜，并采用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）建立了共有模式，結(jié)果顯示各批樣品相似度為0.829～0.948，表明其指紋圖譜基本一致，品質(zhì)較穩(wěn)定。再采用中位數(shù)法，經(jīng)多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配后共生成了15 個(gè)共有峰，指認(rèn)了其中5 個(gè)，分別為原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、反式對(duì)羥基肉桂酸、阿魏酸。藥理研究表明，酚酸類成分具有消除自由基、抗炎、抗病毒、抗氧化等［19?20］活性，也與龍骨風(fēng)功效相關(guān)，故本實(shí)驗(yàn)選取這5 種成分作為指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明同一成分在不同批次樣品中存在較大的差異，可能受藥材生長(zhǎng)的地理環(huán)境、生長(zhǎng)年限、采收季節(jié)、儲(chǔ)存條件等因素的影響。

4 結(jié)論

本研究首次采用HPLC 指紋圖譜結(jié)合聚類分析、主成分分析、含量測(cè)定對(duì)11 批龍骨風(fēng)進(jìn)行研究，所建立的方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好。通過(guò)對(duì)龍骨風(fēng)藥材指紋圖譜的初步研究，可為其質(zhì)量控制提供依據(jù)也能為探索譜效關(guān)系、明確其主要有效成分奠定基礎(chǔ)。