陸柳君，林 敏，周宇軒，葛 暢，何藝敏，張玉琴，黃慶勇，葉 淼*

（1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州350122； 2.泉州醫(yī)學高等?？茖W校，福建 泉州 362011）

近年來，腦卒中一直為人類首位致死因素［1］，我國現(xiàn)有患者1 300 萬，防治刻不容緩［2］。研究表明，谷氨酸興奮性毒性是其主要發(fā)病機制之一，興奮性毒性即由于大腦缺血缺氧后，引起谷氨酸迅速過量釋放或重攝取抑制，導致細胞外谷氨酸水平增加，進而過度活化谷氨酸受體，激活細胞外鈣離子內流等一系列信號通路，最終造成神經元功能異常和死亡，抑制興奮性毒性可減輕缺血性腦組織損傷［3?4］。

栝樓Trichosanthes kirilowiiMaxim.為葫蘆科栝樓屬植物，其干燥根可入藥，名為天花粉，具有清熱瀉火、消腫排膿的功效。以天花粉為君藥的栝樓桂枝湯在臨床上能顯著改善腦卒中后患者肢體痙攣狀態(tài)［5］，其改良方栝樓桂枝顆粒獲批福建省第二人民醫(yī)院院內制劑（批件號閩2013S0001）?，F(xiàn)代藥理研究表明，天花粉對大鼠腦缺血再灌注損傷具一定的神經保護作用［6?7］，但其藥效成分未明。文獻已報道的天花粉化學成分有三萜、甾體［8?10］、木脂素［8?9］、核苷酸［11］、天花粉 蛋白及 多糖等［10］，但其減輕腦缺血損傷的有效成分鮮有報道。課題組前期研究證明，栝樓中的瀉根醇酸能夠減輕興奮性氨基酸引起PC12 細胞損傷［12］。

在此基礎上，本實驗對天花粉化學成分進行研究，從中分離并鑒定了9 個化合物，其中2～3、5、7 為首次從栝樓屬分離得到，6、8～9 為天花粉中首次分離得到。另外，化合物3 為不常見的24?乙基膽甾醇糖苷，前期文獻未報道該化合物及其苷元的波譜數(shù)據(jù)，本實驗通過與文獻對照，首次報道其完整碳譜及典型氫譜數(shù)據(jù)。同時，結合化合物1、5～7 的碳譜特征及前人總結規(guī)律，歸納了3 種情況下長鏈不飽和脂肪酸或酯中雙鍵構型的鑒定方法，對于鑒定長鏈不飽和脂肪酸或酯的結構有較好的借鑒意義。最后，藥理實驗表明含量最高的化合物1能顯著改善谷氨酸損傷PC12 細胞形態(tài)，提高細胞活力，減少LDH 釋放量，在一定程度上減輕谷氨酸對PC12 細胞的損傷。

1 材料

Avance Ⅲ400 MHz 核磁共振儀（美國Bruker公司）；DECAX?30000 LCQ Deca XP 離子阱質譜儀（美國ThermoFinnigan 公司）；Waters 自動純化系統(tǒng)、Waters Zspray 電子噴霧質譜雙檢測器（美國Waters 公司）；LC?20A 分析兼半制備高效液相色譜（配置法國SEDEX 蒸發(fā)光散射檢測器）；柱色譜硅膠（100～200、200～300 目，上海盛亞化工有限公司）；MCI GEL CHP20 微孔樹脂柱（日本三菱化學株式會社）；ODS?A 反相柱（北京綠百草科技發(fā)展有限公司）；Strata C18?E 硅膠基 質固相萃?。⊿PE）小柱（美國Phenomenex 公司）；薄層色譜硅膠板GF254（青島海洋化工廠）；分析純及色譜純試劑（國藥集團化學試劑有限公司）。

PC12 細胞（北京北卡創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院）；胰蛋白酶、RPMI?1640 培養(yǎng)基、胎牛血清均購于美國Hyclone 公司；谷氨酸、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購于美國Sigma 公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。SW?CJ?2FD 超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；Infinite M200 Pro 酶聯(lián)免疫檢測儀（瑞士TECAN 公司）；YS100 倒置顯微鏡（江南光電集團有限公司）。

天花粉（38.0 kg）購自河北省安國市天康藥材有限公司，經福建中醫(yī)藥大學楊成梓教授鑒定為葫蘆科栝樓屬植物栝樓Trichosanthes kirilowiiMaxim.的干燥根。

2 提取與分離

天花粉（38.0 kg）用甲醇進行熱回流提取3次，每次8 h，減壓濃縮得甲醇提取物（3.2 kg）。依次用石油醚和乙酸乙酯進行萃取4 次。得石油醚、乙酸乙酯和水3 個部位。其中乙酸乙酯部位（160.3 g）用硅膠柱CH2Cl2?CH3OH（20 ∶1、15 ∶1、9 ∶1、7 ∶1、3 ∶1、1 ∶1、0 ∶1）梯度洗脫，得到7 個餾分（Fr.1～7）。Fr.1（16.5 g）經C18反相柱（95% CH3OH?H2O）洗脫后，再經反相半制備HPLC（93% CH3CN?H2O）進一步純化，得化合物9（2.8 mg）。Fr.2（19.2 g）經硅膠柱CH2Cl2?CH3OH（18 ∶1）洗脫，得Fr.2.1～5。Fr.2.1 經MCI 柱經90% CH3OH?H2O 洗脫，半制備HPLC（93% CH3OH?H2O）純化得化合物5（9.44 mg）。Fr.2.3 的SPE 固相萃取柱50% CH3OH?H2O洗脫部分得化合物4（9.3 mg）；SPE 的95%CH3OH?H2O 洗脫部分（36.5 mg）經半制備HPLC（92% CH3CN?H2O）純化得化合物6（4.1 mg）、7（5.6 mg）。Fr.3（11.5 g）采用硅膠柱，CH2Cl2?CH3OH（15 ∶1、10 ∶1、5 ∶1）梯度洗脫，得Fr.3.1～4。Fr.3.2（92.3 mg）經SPE 固相萃取柱70% CH3OH?H2O 洗脫后，得化合物8（6.5 mg）。Fr.3.4（55.2 mg）經 C18反相柱 CH3OH?H2O（80%～100%）梯度洗脫，收集90%洗脫部分，經半制備HPLC（95%CH3CN?H2O）純化，得化合物3（6.4 mg）、2（13.7 mg）。Fr.5（28.4 g）經MCI CH3OH?H2O（80%～100%）梯度洗脫，取其80%洗脫組分（1.1 g）中的52.5 mg，經半制備HPLC（94%CH3OH?H2O）純化，得化合物1（18.2 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：白色粉末。ESI?MSm／z：714.5［M＋H］＋，分子量713。1H?NMR（400 MHz，C5D5N）δ：8.42（1H，d，J＝8.92 Hz，NH），6.00（1H，dd，J＝15.40，6.30 Hz，H?4），5.92（1H，dd，J＝15.40，6.28 Hz，H?5），5.51（2H，m，H?8，9），4.93（1H，d，J＝7.76 Hz，H?1″），4.85（1H，m，H?2），4.78（1H，m，H?3），4.75（1H，dd，J＝10.73，5.81 Hz，H?1a），4.61（1H，dd，J＝8.00，3.68 Hz，H?2′），4.53（1H，dd，J＝11.90，2.32 Hz，H?6″a），4.38（1H，dd，J＝11.84，5.36 Hz，H?6″b），4.25（1H，dd，overlapped，H?1b），4.24（2H，dd，overlapped，H?3″，4″），4.07（1H，dd，overlapped，H?2″），3.92（1H，m，H?5″），2.10～2.21（4H，m，H2?6，10），1.98～2.09（2H，m，H?7），1.26（br s，20×CH2，H?3′～15′，11～17），0.87（6H，t，J＝6.97 Hz，CH3?16′，18）；13C?NMR（100 MHz，C5D5N）δ：175.5（C?1′），131.9（C?5），131.7（C?4），130.9（C?9），129.7（C?8），105.4（C?1″），78.3（C?5″），78.2（C?3″），74.9（C?2″），72.3（C?2′），72.1（C?3），71.3（C?4″），69.9（C?1），62.4（C?6″），54.3（C?2），35.4（C?3′），32.7（C?6），32.6（C?10），32.5（C?7），32.5（C?14′），31.8～29.2（16×CH2，C?4′～13′，11～16），22.7（C?15′，17），14.1（C?16′，18）。以上數(shù)據(jù)與文獻［13］ 基本一致。此外，課題組還利用Johns 等［14］總結的判斷不飽和長鏈脂肪酸中雙鍵構型的方法，進一步確認了Δ4E和Δ8E構型。長鏈中2 個雙鍵間隔2 個及2 個以上亞甲基，Z型雙鍵鄰位亞甲基的化學位移約δ27；E型的約δ32；顯然，化合物1碳譜中的3 個化學位移在δ32 左右的碳信號（C?6、7、10）證明了Δ4E和Δ8E構型。故鑒定為大豆腦苷I。

化合物2：白色粉末。ESI?MSm／z：579.4 ［M＋H］＋，分子量578。1H?NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.01（1H，d，J＝7.68 Hz，H?1′），4.61（1H，br d，J＝11.68 Hz，H?6′a），4.44（1H，dd，J＝11.92，5.32 Hz，H?6′b），4.30（1H，t，J＝8.96 Hz，H?4′），4.27（1H，t，J＝9.00 Hz，H?3′），4.05（1H，dd，overlapped，H?2′），3.97（1H，dd，overlapped，H?5′），3.96（1H，m，H?3），1.24（2H，m，H2?28），1.00（3H，d，J＝6.76 Hz，CH3?21），0.99（3H，s，CH3?19），0.89（3H，t，J＝7.36 Hz，CH3?29），0.87（3H，d，overlapped，CH3?27），0.86（3H，d，overlapped，CH3?26），0.61（3H，s，CH3?18）；13C?NMR（100 MHz，C5D5N）δ：102.7（C?1′），78.9（C?3），77.6（C?5′），76.3（C?3′），74.8（C?4′），72.3（C?2′），63.4（C?6′），57.1（C?14），56.8（C?17），54.7（C?9），46.9（C?24），44.2（C?5），42.9（C?13），39.8（C?12），38.1（C?4），37.6（C?1），36.0（C?20），35.5（C?10），34.5（C?22），32.6（C?7），31.2（C?2），30.4（C?8），29.4（C?25），28.9（C?6），28.6（C?16），26.2（C?23），23.8（C?15），23.4（C?28），21.1（C?11），20.0（C?26），19.1（C?27），18.3（C?21），12.9（C?29），12.6（C?19），11.9（C?18）。以上數(shù)據(jù)與文獻［15］ 基本一致。但是，課題組認為該文獻中有關豆甾烷醇?3?O?β?D?葡萄糖苷中C?24 的立體構型的確定嚴謹不足。根據(jù)Wright 等［16］總結的數(shù)對互為C?24 位差向異構體膽甾烷類化合物的碳譜規(guī)律，可依據(jù)C?20、C?23～27 的碳譜數(shù)據(jù)差異來判斷C?24 構型。由于C?24 位差向異構體的以上碳譜數(shù)據(jù)差值很小，因此需要將甾體苷水解后，用苷元的碳譜數(shù)據(jù)進行判斷。因此認為化合物2 的C?24 的立體構型暫無法確定，故鑒定為（24ξ）?24?乙基?膽甾?3?O?β?D?葡萄糖苷。

化合物3：白色粉末。ESI?MSm／z：577.4 ［M＋H］＋，分子量576。1H?NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.27（1H，dd，J＝15.28，9.04 Hz，H?22），5.24（1H，dd，J＝15.20，8.96 Hz，H?23），5.03（1H，d，J＝7.96 Hz，H?1′），4.60（1H，br d，J＝11.34 Hz，H?6′a），4.47（1H，dd，J＝12.00，5.33 Hz，H?6′b），4.34（1H，t，J＝9.55 Hz，H?4′），4.32（1H，t，J＝9.55 Hz，H?3′），4.05（1H，dd，overlapped，H?2′），3.97（1H，dd，overlapped，H?5′），3.96（1H，m，H?3），1.26（2H，m，H2?28），1.12（3H，d，J＝7.62 Hz，CH3?21），0.92（3H，s，CH3?19），0.90（3H，t，overlapped，CH3?29），0.88（3H×2，d，J＝5.80 Hz，CH3?26，27），0.62（3H，s，CH3?18）；13C?NMR（100 MHz，C5D5N）δ：138.8（C?22），130.3（C?23），102.6（C?1′），79.0（C?3），77.6（C?5′），75.8（C?3′），74.8（C?4′），72.2（C?2′），63.3（C?6′），57.7（C?17，14），54.7（C?9），51.8（C?24），44.7（C?5），43.9（C?13），40.2（C?20），39.6（C?12），37.9（C?4），37.1（C?1），35.4（C?10），32.5（C?7），31.1（C?25），31.1（C?2），30.4（C?8），28.8（C?6），28.7（C?16），25.6（C?28），23.7（C?15），21.6（C?26），21.6（C?11），21.6（C?21），19.7（C?27），13.3（C?19），12.6（C?18），12.5（C?29）?；衔? 與2 結構中A～D環(huán)的13C?NMR 數(shù)據(jù)幾乎完全一致。但化合物3 的氫譜比2 多了一對反式烯氫信號［δ5.27（1H，dd，J＝15.28，9.04 Hz，H?22）；δ5.24（1H，dd，J＝15.20，8.96 Hz，H?23）］；相應的，化合物3 的碳譜比2 多了2 個烯碳信號［δ138.8（C?22），δ130.3（C?23）］。表明化合物3 為2 的C?22，23 去氫化物。將化合物3 側鏈的碳譜數(shù)據(jù)與文獻［16］對照，幾乎完全一致，類似化合物2，3 中C?24 立體構型亦無法確定，故鑒定為（24ξ）?24?乙基?膽甾?22?烯?3?O?β?D?葡萄糖。在自然界中，24?乙基膽甾醇類 甾體很常見，但多具Δ5、Δ5，22、Δ7、Δ7，22雙鍵，然化合物3 僅有Δ22雙鍵的較為少見，僅在遠 志［17］、盤基網柄菌［18］、Gypsophila struthium［19］中分離得到單體，在番杏［20］中檢測到。且本研究首次報道了其波譜數(shù)據(jù)。

化合物4：白色粉末。ESI?MSm／z：321.0 ［M＋Na］＋，分子量298。1H?NMR（400 MHz，C5D5N）δ：7.47（4H，d，J＝8.25 Hz，H?3，5，3′，5′），7.25（4H，d，J＝8.50 Hz，H?2，6，2′，6′），4.94（2H，d，J＝3.70 Hz，H?7，7′），4.29（2H，dd，J＝8.74，6.86 Hz，H?9a，9′a），3.97（2H，dd，J＝9.20，3.60 Hz，H?9b，9′b），3.18（2H，m，H?8，8′）；13C?NMR（100 MHz，C5D5N）δ：158.3（C?4，4′），132.4（C?1，1′），128.1（C?2，6，2′，6′），116.0（C?3，5，3′，5′），86.0（C?7，7′），71.6（C?9，9′），54.5（C?8，8′）。以上數(shù)據(jù)與文獻［21］ 基本一致，故鑒定為ligballinol。

化合物5：白色粉末。ESI?MSm／z：377.3 ［M＋Na］＋，分子量354。1H?NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.39（4H，m，H?9′，10′，12′，13′），4.20（2H，m，H2?1），3.96（1H，m，H?2），3.70（2H，m，H2?3），2.80（2H，J＝5.18 Hz，H2?11′），2.37（2H，m，H2?2′），2.19（4H，m，H2?8′，14′），1.65（2H，m，H2?3′），1.26（m，7×CH2，H2?4′～7′，15′～17′），0.87（3H，t，J＝7.18 Hz，CH3?18′）；13C?NMR（100 MHz，C5D5N）δ：174.3（C?1′），130.2（C?9′），130.0（C?13′），128.1（C?10′），127.9（C?12′），70.3（C?2），65.1（C?1），63.3（C?3），34.1（C?2′），31.5（C?16′），29.6（C?6′，15′），29.2（C?5′，7′），29.1（C?4′），27.2（C?8′，14′），25.0（C?11′），24.9（C?3′），22.7（C?17′），14.1（C?18′）。以上數(shù)據(jù)與文獻［22］ 基本一致，且通過Johns等［14］總結規(guī)律，確定其Δ9Z，12Z構型，故鑒定為亞油酸甘油酯。

化合物6：淡黃色 油狀物。ESI?MSm／z：281.3 ［M＋H］＋，279.5 ［M?H］＋，分子量280。1H?NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.45（4H，m，H?9，10，12，13），2.88（2H，J＝5.56 Hz，H2?11），2.48（2H，m，H2?2），2.07（4H，m，H2?8，14），1.75（2H，m，H2?3），1.31（br s，7×CH2，H2?4～7，15～17），0.83（3H，t，J＝7.60 Hz，CH3?18）；13C?NMR（100 MHz，C5D5N）δ：180.1（C?1），130.3（C?9），130.1（C?13），128.4（C?10），128.3（C?12），34.0（C?2），31.9（C?16），29.7（C?7），29.4（C?5），29.3（C?15），29.2（C?4，6），27.6（C?8，14），25.3（C?3），25.1（C?11），23.1（C?17），14.3（C?18）。以上數(shù)據(jù)與化合物5 的羧酸部分以及文獻［23］ 基本一致，故鑒定為亞油酸。

化合物7：淡黃色 油狀物。ESI?MSm／z：317.4 ［M＋Na］＋，分子量294。1H?NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.49～5.38（4H，m，H?9，10，12，13），2.90（2H，m，H2?11），2.51（2H，J＝6.72 Hz，H2?2），2.07（4H，m，H2?8，14），1.77（2H，m，H2?3），1.24（br s，8×CH2，H?4～7，15～18），0.92（3H，t，J＝6.58 Hz，CH3?19）；13C?NMR（100 MHz，C5D5N）δ：180.2（C?1），130.4（C?9），130.2（C?13），128.4（C?10，12），34.2（C?2），32.1（C?17），29.8（C?7），29.5（C?5），29.3（C?15），29.2（C?6），29.2（C?4），29.1（C?16），27.4（C?14），27.3（C?8），25.3（C?11），25.0（C?3），23.0（C?18），14.2（C?19）。以上數(shù)據(jù)與文獻［24］ 基本一致，類似化合物6，進一步確認Δ9Z，12Z構型，故鑒定為（9Z，12Z）?9，12?十九碳二烯酸。

化合物8：黃色油狀物。ESI?MSm／z：279.4［M＋Na］＋，255.3 ［M?H］－，分子量256。1H?NMR（400 MHz，C5D5N）δ：2.34（2H，t，J＝8.60 Hz，H2?2），1.63（2H，m，H2?3），1.25（24H，br s，12×CH2，H2?4～15），0.88（3H，t，J＝8.60 Hz，CH3?16）。從其質譜和氫譜數(shù)據(jù)可推測化合物8 為一個典型的不含雙鍵的長鏈脂肪酸，以上數(shù)據(jù)與文獻［25］ 基本一致，故鑒定為正十六烷酸。

化合物9：黃色油狀物。ESI?MSm／z：363.2［M＋Na］＋，375.2 ［M＋Cl］＋，分子量340。1H?NMR（400 MHz，C5D5N）δ：2.55（2H，J＝7.44 Hz，H2?2），1.82（2H，m，H2?3），1.28（36H，br s，18×CH2，H2?4～21），0.88（3H，t，J＝6.68 Hz，CH3?22）。從其質譜和氫譜數(shù)據(jù)可知，化合物9 應為8的同系物，以上數(shù)據(jù)與文獻［26］ 基本一致，故鑒定為正二十二烷酸。

4 對谷氨酸誘導PC12 細胞損傷的保護作用

4.1 細胞培養(yǎng)、藥物處理以及形態(tài)觀察 PC12 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U／mL 青霉素和鏈霉素溶液的RMPI?1640 完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，選取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。取對數(shù)生長期的PC12 細胞，按照2×104個／孔接種于96 孔培養(yǎng)板上，于37 ℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，用PBS 輕輕蕩洗1 次，按分組需要給藥。正常對照組加入等量的1640 培養(yǎng)基；谷氨酸模型組和給藥組分別加入1640 培養(yǎng)基和不同濃度的化合物1，預孵育24 h后，再加入谷氨酸使其終濃度為15 mmol／L，孵育6 h。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

4.2 MTT 法檢測細胞存活率 細胞孵育結束后，每孔加入10 μL 5 mg／mL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO，待藍紫色甲瓚晶體完全溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定570 nm波長下各孔吸光度（A），細胞存活率＝（A實驗組／A對照組）×100%。

4.3 LDH 水平測定 細胞孵育結束后收集細胞上清液，按照試劑盒說明書操作，酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm 波長下測定A，計算LDH 水平。

4.4 化合物1 對谷氨酸損傷PC12 細胞形態(tài)的影響 細胞培養(yǎng)與處理后，采用倒置顯微鏡觀察其形態(tài)變化，并拍攝細胞圖像，結果見圖1。與正常組比較，谷氨酸組的PC12 細胞損傷明顯，細胞形態(tài)變圓、部分細胞脫落；與谷氨酸組比較，不同濃度的化合物1 預處理組PC12 細胞的形態(tài)明顯改善，細胞間鏈接緊密，并且隨著劑量的增加，細胞貼壁數(shù)逐漸增多，生長狀態(tài)良好。

圖1 化合物1 對谷氨酸誘導的PC12 細胞形態(tài)的影響Fig.1 Effect of compound 1 on glutamate?induced PC12 cell morphological changes

4.5 化合物1 對谷氨酸損傷PC12 細胞活力的影響 與正常組比較，給藥組細胞的存活率沒有顯著變化，見圖2A。采用15 mmol／L 谷氨酸處理PC12細胞6 h 后，與正常組比較，谷氨酸組細胞活力下降至50.87%（P＜0.01）；采用0.1、1、10、50、100 μmol／L 的化合物1 預處理PC12 細胞后，細胞活力較模型組有所上升，分別上升至52.24%、53.55%、56.40%、66.81%、74.32%，隨著化合物1 劑量的增加有明顯的量效關系。其中，化合物1 濃度為50 μmol／L（P＜0.05）、100 μmol／L（P＜0.01）時，能顯著提升PC12 細胞活力，見圖2B。4.6 化合物1 對谷氨酸損傷PC12 細胞LDH 釋放的影響 與正常組比較，谷氨酸（15 mmol／L）處理PC12 細胞后，LDH 釋放量增加到261.92%（P＜0.01）。采用0.1、1、10、50、100 μmol／L 的化合物1 預處理PC12 細胞后，LDH 釋放量分別下降至231.13%、223.24%、219.71%、202.63%、182.62%，呈量效關系。其中，化合物1 濃度為50 μmol／L（P＜0.05）、100 μmol／L（P＜0.01）時更顯著，見圖3。

圖2 不同濃度化合物1 對正常PC12 細胞（A）及谷氨酸損傷PC12 細胞（B）活力的影響（， n＝6）Fig.2 Effects of compound 1 at different concentrations on normal（A）and glutamate?induced（B）PC12 cell viability（， n＝6）

圖3 不同濃度化合物1 對谷氨酸誘導損傷的PC12 細胞LDH 釋放的影響（， n＝6）Fig.3 Effects of compound 1 at different concentrations on glutamate?induced LDH leakage（， n＝6）

5 討論

本研究從天花粉的乙酸乙酯部位中分離并鑒定了9 個化合物，包括1 個腦苷脂（1）、2 個甾體糖苷（2～3）、1 個木脂素（4）、1 個脂肪酸甘油酯（5）和4 個長鏈脂肪酸（6～9）。其中，化合物3為僅含Δ22雙鍵的24?乙基膽甾醇糖苷，其結構較為少見，本研究首次報道了其波譜數(shù)據(jù)。

本實驗結合化合物的碳譜特征和文獻［14］，梳理了以下3 種情況的長鏈不飽和脂肪酸或酯中雙鍵構型的鑒定方法：（1）不飽和長鏈中僅一個雙鍵，主要依據(jù)雙鍵鄰位亞甲基的化學位移進行判斷，Z型雙鍵鄰位亞甲基化學位移約δ27，E型的約δ32，此外烯碳化學位移也有細微差異，E型（δ130.6，130.3）較Z型（δ130.0，129.8）更低場；（2）不飽和長鏈含多個雙鍵，2 個雙鍵間隔2 個及以上亞甲基，判斷方法同情況一；（3）不飽和長鏈含多個雙鍵，2 個雙鍵僅間隔1 個亞甲基，可依據(jù)以下3 點判斷，（3.1）2 個雙鍵均為Z型，雙鍵中間亞甲基的化學位移約δ25，若均為E，中間亞甲基化學位移約δ35；（3.2）Z型雙鍵另一鄰位亞甲基（非雙鍵中間亞甲基）化學位移約δ27；E型的為δ32；（3.3）2 個雙鍵均為E，烯碳化學位移（δ131.1、130.9、128.8、128.7）較Z型更低場（δ130.2、130.0、128.2、128.1）。

本次分離鑒定的9 個化合物中，化合物1 含量在天花粉醇提物中占顯著優(yōu)勢，并且其神經保護作用尚未見報道。為了進一步研究天花粉神經保護作用的物質基礎，本實驗檢測其對谷氨酸損傷PC12細胞的保護作用，結果表明它在50、100 μmol／L時，能顯著的改善損傷細胞的形態(tài)，提高細胞活力，同時減少LDH 釋放。文獻表明，化合物8［27］、6［28］的同分異構體混合物共軛亞油酸亦能減輕谷氨酸對于PC12 細胞的損傷，并且都與上調Bcl?2 蛋白表達有關。結合本實驗結論及前人研究成果，推斷天花粉對于缺血性腦卒中的治療作用可能與抑制谷氨酸誘導的興奮性毒性相關，其中化合物1 為其主要藥效物質基礎之一。