宗茹敏王雅麗黃 琪 鄭良超徐國(guó)兵吳德玲*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012； 2.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230012； 3.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230012）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶減退、認(rèn)知功能障礙，Aβ 的沉淀和聚集所形成的老年斑是AD 較明確 的致病因子。知母皂苷B?Ⅱ（timosaponin B?Ⅱ，TSB?Ⅱ）為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的主要成分與活性物質(zhì)，可改善癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［1?2］，發(fā)揮抗癡呆作用。

秀麗隱桿線蟲(chóng)Caenorhabditis elegans屬于線性動(dòng)物門(mén)，具有生存周期短、易于培養(yǎng)操作等特點(diǎn)，已完成全基因組測(cè)序，約40%的基因與人類同源，而且神經(jīng)細(xì)胞發(fā)達(dá)，有利于其用于神經(jīng)方面的疾病研究。CL4176 線蟲(chóng)在肌肉細(xì)胞中表達(dá)人類β?淀粉樣蛋白1?42（Aβ1?42），升高溫度可誘導(dǎo)Aβ1?42表達(dá)量增加，導(dǎo)致線蟲(chóng)癱瘓，可通過(guò)線蟲(chóng)癱瘓表型變化判斷藥物的有效性［3］。daf?16 mRNA 是與壽命胰島素daf?16／FOXO 信號(hào)通路相關(guān)基因，對(duì)線蟲(chóng)壽命的延長(zhǎng)起正向調(diào)節(jié)作用；sod?3 作為daf?16 的靶基因，可通過(guò)催化O2?的去除來(lái)保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激；skn?1 mRNA 表達(dá)也能在一定程度上延緩氧化損傷；hsp?16.2 作為一種經(jīng)Aβ 誘導(dǎo)產(chǎn)生的低分子量多肽，可減輕毒性蛋白質(zhì)累計(jì)造成的損傷，其過(guò)度表達(dá)抑制癱瘓表型的作用也已被證明。目前，關(guān)于TSB?Ⅱ抑制轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)Aβ 聚集作用及機(jī)制鮮有報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)以秀麗隱桿線蟲(chóng)CL4176 為模型，通過(guò)線蟲(chóng)癱瘓、壽命、體內(nèi)活性氧水平、氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激等實(shí)驗(yàn)探討TSB?Ⅱ抑制Aβ 蛋白毒性作用及可能的機(jī)制，以期為AD 治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)N2、轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲(chóng)CL4176 ｛dvIs27 ［pAF29（myo?3／A?Beta 1?42／Iet UTR）＋pAF4（rol?6（su1006）］｝購(gòu)于美國(guó)線蟲(chóng)基因中心（CGC）；大腸桿菌（Escherichia coliOP50 株）受贈(zèng)于中國(guó)科技大學(xué)生命科學(xué)院光壽紅教授。TSB?Ⅱ?qū)φ掌罚ǔ啥悸继厣锟萍加邢薰荆?hào)100420，純度＞98%）。Aβ1?42（上海信裕生物工程有限公司，批號(hào)XY?E11405）；ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、BCA 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P0018AS、批號(hào)P0012S）；細(xì)胞蛋白裂解液（福州飛凈生物科技有限公司，批號(hào)PH0406）；Trizol（美國(guó)Life Technogies 公司，批號(hào)15596018）；DEPC?H2O（上海捷瑞生物工程有限公司，批號(hào)D1007）；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus（美 國(guó) Anovoprotein 公 司，批 號(hào)E096?01）；RevertAidTM firsStrand cDNASynthesis Kit（批 號(hào)K1622）、熒光定量PCR 儀（型號(hào)PIKOREAL 96）（美國(guó)Thermo Scientific 公司；體式顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司，型號(hào)Motic K?400C）；熒光酶標(biāo)儀［美谷分子儀器（上海）有限公司，型號(hào)SpectraMax M4］；普通PCR 儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)K960）；引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行。

2 方法

2.1 NGM 固體培養(yǎng)基（線蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基）與M9溶液的制備及線蟲(chóng)同步化 參考文獻(xiàn)［4?5］ 報(bào)道的方法制備NGM 固體培養(yǎng)基與M9 溶液，對(duì)配置好的NGM 培養(yǎng)基進(jìn)行鋪板，凝固后倒置，在4 ℃冰箱中保存。對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行同步化培養(yǎng)，然后將其轉(zhuǎn)移至NGM 培養(yǎng)皿中，于20 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。

2.2 TSB?Ⅱ溶液制備 取適量TSB?Ⅱ，超純水溶解成960 μg／mL 母液，除菌濾頭過(guò)濾后加入大腸桿菌OP50 配置成質(zhì)量濃度為640、160、40、10、2.5、0.625 μg／mL 的溶液，各取300 μL 鋪在NGM 板中，每個(gè)質(zhì)量濃度鋪3 塊板。

2.3 癱瘓實(shí)驗(yàn) 用M9 緩沖液將產(chǎn)卵期CL4176 線蟲(chóng)洗至離心管進(jìn)行離心處理，棄去上清液，重復(fù)3次后加入與M9 等體積的裂解液，待線蟲(chóng)全部裂解后離心，棄去上清液，將蟲(chóng)卵鋪在新的NGM 板中，于16 ℃下培養(yǎng)至孵化成蠕蟲(chóng)后，轉(zhuǎn)移至TSB?Ⅱ的各給藥濃度組，升溫至25 ℃誘導(dǎo)Aβ1?42基因表達(dá)和線蟲(chóng)癱瘓。用挑針輕觸線蟲(chóng)，線蟲(chóng)保持頭動(dòng)而身體不動(dòng)，則判定為癱瘓［6］。

2.4 壽命實(shí)驗(yàn) 產(chǎn)卵期CL4176 線蟲(chóng)同步化后，將蟲(chóng)卵鋪于NGM 板中16 ℃孵化12 h 后轉(zhuǎn)移至TSB?Ⅱ的3 個(gè)最佳給藥濃度組（TSB?Ⅱ?40、TSB?Ⅱ?10、TSB?Ⅱ?2.5）及空白組培養(yǎng)，每個(gè)濃度平行3 塊板，每3 d 記錄線蟲(chóng)存活情況，直至全部死亡為止，對(duì)其壽命做生長(zhǎng)曲線，考察TSB?Ⅱ?qū)D(zhuǎn)基因線蟲(chóng)是否有毒性作用［7］。用挑針輕觸線蟲(chóng)頭部和尾部，若30 s 內(nèi)均無(wú)反應(yīng)，則判定為死亡。

2.5 活性氧（ROS）檢測(cè) 產(chǎn)卵期CL4176 線蟲(chóng)同步化后，將蟲(chóng)卵鋪在NGM 板上孵化，轉(zhuǎn)移至TSB?Ⅱ的3 個(gè)最佳給藥濃度組（TSB?Ⅱ?40、TSB?Ⅱ?10、TSB?Ⅱ?2.5）及空白組，于16 ℃培養(yǎng)36 h，升溫給藥板至25 ℃培養(yǎng)36 h，將線蟲(chóng)于EP 管中用PBS 沖洗3 次后，在含H2DCF?DA 的PBS?T 中孵育3 h，每10 min 渦旋1 次，熒光酶標(biāo)儀于溫度37 ℃、激發(fā)光波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)530 nm 下測(cè)定熒光強(qiáng)度［8］，平行3 次。

2.6 Aβ 體外沉積實(shí)驗(yàn) 將適量Aβ1?42用六氟異丙醇（HFIP）冰浴超聲10 min，溶解成質(zhì)量濃度為1 mg／mL，吹去HFIP，將管內(nèi)壁透明的肽層溶于DMSO 中，PBS 稀釋成濃度為0.025 mmol／L 的溶液。取Aβ 淀粉樣蛋白10 μL、不同濃度TSB?Ⅱ組20 μL，加到96 孔板中混合均勻后，于37 ℃下避光孵育，加入用0.1 mol／L 甘氨酸緩沖液200 μL（pH＝8.9）配制的0.01 mmol／L 的ThT 混勻顯色，采用熒光酶標(biāo)儀，在激發(fā)光波長(zhǎng)450 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)485 nm 下測(cè)量熒光強(qiáng)度［9］，平行3 次。

2.7 氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 挑取處于產(chǎn)卵期的N2 線蟲(chóng)，在NGM 平板上產(chǎn)卵3 h。將孵出的蠕蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到空白組與不同濃度TSB?Ⅱ組，在20 ℃下培養(yǎng)至3 d后，轉(zhuǎn)移至含有胡桃醌（0.2 mmol／L）的NGM 板上，每隔1 h 觀察蠕蟲(chóng)存活情況1 次，直至線蟲(chóng)全部死亡［10?11］，平行3 次。

2.8 熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 挑取處于產(chǎn)卵期的N2 線蟲(chóng)，在NGM 平板上產(chǎn)卵3 h。將產(chǎn)下的卵孵出的蠕蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到空白組與不同濃度TSB?Ⅱ組板上，在20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d 后升溫至35 ℃，每隔1 h 觀察線蟲(chóng)存活情況1 次，直至線蟲(chóng)全部死亡［12］，平行3 次。

2.9 TSB?Ⅱ?qū)^(guò)氧化氫酶的影響 線蟲(chóng)同步化后蟲(chóng)卵加到NGM 板上，置于16 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化12 h，將蠕蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至空白組與不同濃度TSB?Ⅱ組板上，置于16 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化24 h 后升溫至25℃孵化36 h，以誘導(dǎo)Aβ 基因表達(dá)。M9 緩沖液收集各組線蟲(chóng)于EP 管內(nèi)，蛋白裂解液（1 mmol／L PMSF）冰浴超聲提取線蟲(chóng)體內(nèi)總蛋白，BCA 法對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行顯色，最后通過(guò)紫外酶標(biāo)儀檢測(cè)，計(jì)算相應(yīng)數(shù)值，平行3 次。

2.10 β 淀粉樣蛋白寡聚體的點(diǎn)印記分析 對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)各給藥組總蛋白進(jìn)行定量分析后，計(jì)算不同濃度組蛋白含量，再確定不同濃度給藥組蛋白印跡分析時(shí)的上樣量，蛋白定量點(diǎn)樣在0.22 μm NC 膜上，自然揮干后在室溫下用TBST 配置的5%脫脂奶粉封閉1 h，1×TBST 于搖床上洗3 次，每次5 min，4 ℃下與一抗A11 孵育搖床振搖過(guò)夜，1×TBST 于搖床上洗3 次，將膜與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗搖床振搖孵育1 h，1×TBST 于搖床上洗3 次，膜加入顯影液后放入凝膠成像儀中避光顯色并拍照，曝光時(shí)間根據(jù)膜曝光程度調(diào)整至最佳狀態(tài)，通過(guò)凝膠圖像處理系統(tǒng)分析光密度值。

2.11 實(shí)時(shí)熒光定量 重復(fù)“2.10”項(xiàng)下步驟誘導(dǎo)Aβ 基因表達(dá)，加M9 緩沖液沖洗2～3 次后離心，吸取上層緩沖液，蟲(chóng)體放入－80 ℃冰箱中凍存數(shù)小時(shí)后，采用Trizol 法提取線蟲(chóng)總RNA，取3 μg至EP 管中，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)使其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，于－80 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄幸?jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 分析方法為 Relative Quantification Study，計(jì)算方法為2－△△Ct。通 過(guò)GraphPad Prism 6.01 軟件進(jìn)行處理，Image J 軟件分析熒光強(qiáng)度，重復(fù)3 次，取平均值。

3 結(jié)果

3.1 TSB?Ⅱ?qū)€蟲(chóng)癱瘓、壽命、活性氧、氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激等實(shí)驗(yàn)的影響 如圖1a 所示，相比空白組，不同濃度TSB?Ⅱ組均有一定的抗線蟲(chóng)癱瘓作用（P＜0.05），其中TSB?Ⅱ?40 組效果最佳，后期選取TSB?Ⅱ?40、TSB?Ⅱ?10、TSB?Ⅱ?2.5 組作進(jìn)一步考察。如圖1b 所示，不同濃度TSB?Ⅱ組在一定程度上也可延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命（P＜0.05）。如圖1c所示，模型組線蟲(chóng)體內(nèi)ROS 高于不同濃度TSB?Ⅱ組、空白組，表明誘導(dǎo)Aβ基因表達(dá)后出現(xiàn)AD 表觀癥狀時(shí)，線蟲(chóng)體內(nèi)ROS 水平相比空白組是增加的；不同濃度TSB?Ⅱ組相比模型組，均能在一定程度上降低線蟲(chóng)體內(nèi)ROS 產(chǎn)生（P＜0.01）。如圖1d 所示，不同濃度TSB?Ⅱ組相比空白組，能延長(zhǎng)線蟲(chóng)死亡時(shí)間，以TSB?Ⅱ?40 作用最好（P＜0.05）。如圖1e～1f 所示，相比模型組，不同濃度TSB?Ⅱ組均能減弱線蟲(chóng)受到的熱應(yīng)激損傷作用（P＜0.05），但對(duì)轉(zhuǎn)基因線蟲(chóng)體內(nèi)過(guò)氧化氫酶無(wú)明顯影響（P＞0.05）。TSB?Ⅱ?qū)€蟲(chóng)癱瘓、壽命、氧化應(yīng)激與熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)的影響見(jiàn)表2。

表2 TSB?Ⅱ數(shù)據(jù)秩和檢驗(yàn)Tab.2 Kruskal?Wallis tests for TSB?Ⅱdata

3.2 TSB?Ⅱ?qū)β 體外聚集的影響 如圖2 所示，相比空白組，不同濃度TSB?Ⅱ組均能在一定程度上降低β 淀粉樣蛋白的聚集（P＜0.01）。

圖2 TSB?Ⅱ?qū)β 體外聚集的影響（， n＝3）Fig.2 Effect of TSB?Ⅱon the in vitro aggregation of Aβ（， n＝3）

3.3 TSB?Ⅱ?qū)β 體內(nèi)聚集的影響 如圖3 所示，升溫誘導(dǎo)的線蟲(chóng)灰度值最高；相比模型組，不同濃度TSB?Ⅱ組均能降低線蟲(chóng)體內(nèi)Aβ 聚集和沉積（P＜0.01）。

圖3 TSB?Ⅱ?qū)β 體內(nèi)聚集的影響（， n＝3）Fig.3 Effect of TSB?Ⅱon the in vivo aggregation of Aβ（， n＝3）

3.4 TSB?Ⅱ?qū)D 相關(guān)基因表達(dá)的影響 如圖4所示，相比模型組，TSB?Ⅱ?40 組可上調(diào)sod?3、hsp?16.2、daf?16 mRNA 表達(dá)，下調(diào)skn?1、amy?1 mRNA 表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），而TSB?Ⅱ?2.5組sod?3 mRNA 表 達(dá)，TSB?Ⅱ?10、TSB?Ⅱ?2.5 組daf?16 mRNA 表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

圖4 TSB?Ⅱ?qū)D 相關(guān)基因表達(dá)的影響（， n＝3）Fig.4 Effects of TSB?Ⅱon the expressions of AD?related genes（， n＝3）

4 討論

AD 的治療與治愈是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，其主要病理學(xué)特征為大腦皮質(zhì)萎縮和Aβ 沉積形成的老年斑，表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶減退、認(rèn)知功能障礙。但其發(fā)病機(jī)制并未完全闡明，目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的學(xué)說(shuō)有Aβ 沉積學(xué)說(shuō)。Aβ 是由一個(gè)跨膜糖蛋白淀粉樣前體蛋白（APP）經(jīng)β 和γ 分泌酶水解產(chǎn)生的一段中間肽鏈。有研究證明，Aβ 的過(guò)度產(chǎn)生以及促進(jìn)Aβ 的聚集和沉積或抑制Aβ 沉積物的清除是導(dǎo)致阿爾茨海默病的主要原因之一。正常情況下Aβ的產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)體內(nèi)平衡遭到破壞時(shí)易引起Aβ 的沉淀和聚集，進(jìn)而激發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用于線粒體，影響能量代謝，加速Tau 蛋白磷酸化，神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成和降低興奮性閾值等途徑發(fā)揮神經(jīng)毒性，因此調(diào)控Aβ 的形成與代謝對(duì)于AD 的預(yù)防和治療具有重要作用。SOD 作為常見(jiàn)抗氧化酶之一，能一定程度抵御氧化應(yīng)激與清除體內(nèi)活性氧。胰島素信號(hào)通路是重要的壽命調(diào)節(jié)通路，daf?16 mRNA 是調(diào)節(jié)衰老的下游組件，其大量表達(dá)能夠延緩衰老，延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命，sod?3 作為daf?16 的靶基因，可通過(guò)催化的去除保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激。小分子熱休克蛋白hsp?16.2 是一種低分子量多肽，存在大部分機(jī)體中，該基因的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)新生Aβ 蛋白的清除從而減緩Aβ 蛋白的毒性。skn?1 mRNA 是與氧化誘導(dǎo)反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，基因的表達(dá)可以調(diào)控抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，一定程度上延緩氧化損傷。amy?1 mRNA可能協(xié)調(diào)參與升溫誘導(dǎo)后A 溫基因的表達(dá)導(dǎo)致的癱瘓。

本研究以秀麗隱桿線蟲(chóng)CL4176 為模型，探討了不同濃度TSB?Ⅱ?qū)€蟲(chóng)癱瘓、壽命、活性氧、氧化損傷及熱應(yīng)激損傷和Aβ 的產(chǎn)生、聚集等方面的影響，結(jié)果表明TSB?Ⅱ不同濃度給藥組均能一定程度上抗線蟲(chóng)癱瘓、延長(zhǎng)線蟲(chóng)壽命、降低活性氧、減輕氧化損傷及熱應(yīng)激損傷。通過(guò)藥物與Aβ1－42蛋白單體共孵育，發(fā)現(xiàn)藥物不同濃度組均能一定程度上降低Aβ 的體外聚集。通過(guò)Aβ 寡聚體的點(diǎn)印記分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析發(fā)現(xiàn)TSB?Ⅱ可上調(diào)線蟲(chóng)體內(nèi)sod?3、hsp?16.2、daf?16 mRNA的表達(dá)和下調(diào)skn?1 和amy?1 mRNA 的表達(dá)，由此可知TSB?Ⅱ能夠增強(qiáng)秀麗隱桿線蟲(chóng)CL4176 對(duì)于氧化應(yīng)激和熱應(yīng)激的耐受性，降低Aβ 蛋白的聚集和沉積，具有保護(hù)神經(jīng)元的作用，其對(duì)Aβ 的產(chǎn)生、聚集的抑制作用可能與壽命胰島素信號(hào)通路相關(guān)。