張 蕾，黃華明，周 杰，聶 超*

（1.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江蘇 南京211800； 2.無錫市錫山人民醫(yī)院，江蘇 無錫 214015）

宮頸癌是一種嚴(yán)重危害女性健康的常見惡性腫瘤，每年世界新增患者達(dá)幾十萬人。盡管宮頸癌疫苗的使用和篩查手段不斷更新，患病率已經(jīng)降低［1］，但化療對術(shù)前縮小病灶增加手術(shù)機(jī)會、術(shù)后防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及晚期轉(zhuǎn)移性宮頸癌仍起著不可替代的作用［2］。由于化療藥物缺乏理想療效、不良反應(yīng)較強(qiáng)等問題［3］，中藥替代或與現(xiàn)有藥物聯(lián)合使用正成為當(dāng)前新的趨勢。

原花青素（proanthocyanidins，PC）是一種黃酮類化合物，廣泛存在于各種植物的核、皮、種籽等部位，在葡萄籽中含量最高，也是多種中藥的主要成分之一［4］，有著抗炎、降血壓、抗白血病、抗動脈粥樣硬化、抗氧化等功效［5?6］，同時其來源廣泛，不良反應(yīng)低，受到了人們廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)將原花青素作用于宮頸癌HeLa 細(xì)胞，觀察藥物對細(xì)胞侵襲和遷移的影響，并討論藥物抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）產(chǎn)生作用的機(jī)制，以期為該成分開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人宮頸癌HeLa 細(xì)胞購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司（KG042），置于完全培養(yǎng)基（90%DMEM ＋10% CS）中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑與藥物 原花青素（南京澤朗生物科技有限公 司，ZL20170515012，純度＞ 98%）。SB431542（美國Sigma 公司，616464）；TRIzol（美國Invitrogen 公司，15596026）；氯仿（865?49?6）、異丙醇（67?63?0）（上海賢鼎生物科技有限公司）；MTT（北京索萊寶科技有限公司，IM0280）；Transwell 小室（美國Chemicon 公司，ECM550）；PBS（含EDTA）（KGY0012）、全蛋白抽提試劑盒（KGP250）、5×SDS?PAGE 蛋白上樣緩沖液（KGP101）、SDS?PAGE 凝膠配制試劑盒（KGP113）、Western?blot一抗TGFβ1（KGYT4632?6）、E?cadherin（KGYT1453?6）、Smad2（KG21323?2）、Smad3（KG21325?2）、pSmad2（KG11322）、pSmad3（KG11325?2）、內(nèi)參一抗GAPDH（KGAA002－1）、二抗（KGP1201）、ECL檢測試劑盒（KGP1121）（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；Smad7（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，25840－1?AP）。

2 方法

2.1 MTT 法檢測細(xì)胞增殖 將細(xì)胞配制成濃度為5×104／mL 的細(xì)胞懸液，96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100 μL 細(xì)胞懸液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需質(zhì)量濃度（100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg／L），每孔加入100 μL 相應(yīng)含藥培養(yǎng)基，同時設(shè)立陰性對照組、陽性對照組，將96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行MTT 染色，在490 nm 波長下測定光密度（OD）值，計算抑制率。

2.2 劃痕法檢測細(xì)胞遷移 將對數(shù)生長期的細(xì)胞配制成濃度為5×104／mL 的細(xì)胞懸液，接種到6 孔板中，加入相應(yīng)的含藥無血清培養(yǎng)基，同時設(shè)立陰性對照組。次日，待細(xì)胞集合度達(dá)60% 左右后用無菌槍頭在6 孔板中均勻劃線，PBS 洗去漂浮細(xì)胞，換新鮮培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于12、24 h 取出細(xì)胞，拍照（放大倍數(shù)100×），測量細(xì)胞遷移距離。

2.3 Transwell 檢測細(xì)胞侵襲 將對數(shù)生長期的細(xì)胞配制成濃度為5×104／mL 的細(xì)胞懸液，接種到6孔板中。次日，待細(xì)胞貼壁后根據(jù)組別設(shè)置（100、50、25 mg／L）加入相應(yīng)含藥培養(yǎng)基，同時設(shè)立陰性對照組，將Matrigel 基質(zhì)膠在4 ℃下過夜融化，不完全培養(yǎng)基稀釋1 倍，Transwell 上室加入30 μL 稀釋的Matrigel，37 ℃下孵育120 min，使Matrigel 聚合成膠，不完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105／mL，取100 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 小室，下室加入500 μL 含20% FBS 的培養(yǎng)基，將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)細(xì)胞，移去Transwells，倒置，風(fēng)干，在24 孔板中加入500 μL 0.1%結(jié)晶紫，將小室置于其中，使膜浸沒在染料中，37 ℃下反應(yīng)30 min 后取出，PBS 清洗，直徑上取3 個視野，照相（×200），計數(shù)。

2.4 免疫熒光觀察蛋白變化 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104／mL，根據(jù)組別設(shè)置（100、50、25 mg／L）加入相應(yīng)含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后將2 種細(xì)胞自然晾干，4%多聚甲醛固定液浸泡30 min，PBS 浸洗3 次，依次滴加3%H2O2?甲醇溶液2 滴、即用型山羊血清75 μL，室溫下孵育20 min。在37 ℃下滴加一抗（1 ∶100 稀釋）75 μL，孵育2 h，PBS 浸洗3 次；FITC（1 ∶200 稀釋）二抗75 μL，避光孵育1 h，PBS 浸洗3次，滴加DAPI 染液后用防萃滅封片膠封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞3 個高表達(dá)區(qū)域并拍照保存。使用Image?Pro Plus 6.0 軟件計算視野面積下光密度（IOD），求得平均光密度，公式為平均光密度＝IOD／視野面積。

2.5 Western blot 檢測蛋白表達(dá) 將對數(shù)生長期的細(xì)胞消化接種到6 孔板中，次日待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)組別設(shè)置（100、50、25 mg／L）加入相應(yīng)含藥培養(yǎng)基，同時設(shè)立陰性對照組，各組加入200 μL冰預(yù)冷裂解緩沖液，混勻后冰浴30 min，常規(guī)渦旋后，14 000 r／min、4 ℃離心15 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，10% SDS?PAGE 凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到聚氟乙烯（PVDF）膜上，5% 脫脂牛奶過夜封閉，加入一抗（1 ∶200），過夜孵育于4 ℃封閉袋中，二抗（1 ∶4 000）孵育（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體）1 h，其間每一步都用TBST洗膜3 次，每次10 min。凝膠成像系統(tǒng)成像，Gel?Pro32 軟件進(jìn)行灰度分析。

2.6 熒光定量PCR 檢測基因表達(dá) 將對數(shù)生長期宮頸癌HeLa 細(xì)胞提取總RNA，測定純度后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用熒光染色法和熒光定量PCR 儀進(jìn)行實(shí)時定量PCR，引物由江蘇凱基生物科技有限公司合成，序列分別為GAPDH primer（90 bp）［5′?AGATCATCAGCAATGCCTCCT?3′、5′?TGAGTCCTTC CACGATACCAA?3′］、E?cadherin primer（108 bp）［5′?CCAAGCAGCAGTACATTCTACA?3′、5′?CATT CACATCCAGCACATCCA?3′］，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火／延伸20 s，72 ℃變性40 s，共40 個循環(huán)，產(chǎn)物特異性用溶解曲線監(jiān) 測。采 用 Rotor?Gene Real?Time Analysis Software 6.1 分析軟件及ΔΔCT法定量分析擴(kuò)增曲線及溶解曲線，以GAPDH 為內(nèi)參衡量靶細(xì)胞目的基因表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 16.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 原花青素對HeLa 細(xì)胞增殖的影響 原花青素質(zhì)量濃度在0～50 mg／L 之間時，對宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制率無明顯變化并較低，僅大約為10%，而且差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；從100 mg／L開始抑制率顯著提升，最高可達(dá)44.73%。為了避免原花青素由于抑制宮頸癌細(xì)胞而產(chǎn)生抑制侵襲遷移作用，劃痕、Transwell 實(shí)驗(yàn)選取50 mg／L 作為其質(zhì)量濃度。見圖1。

圖1 原花青素對HeLa 細(xì)胞增殖的影響（， n＝6）Fig.1 Effect of proanthocyanidins on HeLa cell proliferation（， n＝6）

3.2 原花青素對HeLa 細(xì)胞遷移的影響 對照組細(xì)胞保持了原有的遷移能力；原花青素干預(yù)后12、24 h 細(xì)胞遷移距離縮短，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 原花青素對HeLa 細(xì)胞遷移的影響（， n＝3，×100）Fig.2 Effect of proanthocyanidins on the migration of HeLa cells（， n＝3，×100）

3.3 原花青素對HeLa 細(xì)胞侵襲的影響 對照組在不同時間點(diǎn)穿模細(xì)胞數(shù)呈上升趨勢；50 mg／L 原花青素干預(yù)12、24 h 后，穿膜細(xì)胞數(shù)與對照組比較得到了抑制（P＜0.05，P＜0.01），并呈時間依賴性。見圖3。

圖3 原花青素對HeLa 細(xì)胞侵襲的影響（， n＝3，×200）Fig.3 Effect of proanthocyanidins on the invasion of HeLa cells（， n＝3，×200）

3.4 原花青素對HeLa 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白的影響 TGF?β1 蛋白光密度在對照組中最高，而不同劑量原花青素干預(yù)后降低（P＜0.05，P＜0.01）；E?cadherin 蛋白光密度在對照組中最低，而不同劑量原花青素干預(yù)后升高（P＜0.05，P＜0.01），并均呈濃度依賴性。見圖4。

圖4 原花青素對HeLa 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白的影響（， n＝3）Fig.4 Effect of proanthocyanidins on EMT?related proteins in HeLa cells（， n＝3）

3.5 原花青素對HeLa 細(xì)胞中TGF?β1、E?cadherin蛋白表達(dá)的影響 TGF?β1 蛋白表達(dá)在對照組中最高，而原花青素干預(yù)后降低（P＜0.05，P＜0.01）；E?cadherin 蛋白表達(dá)在對照組中最低，而原花青素干預(yù)后升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5。

圖5 原花青素對HeLa 細(xì)胞中TGF?β1、E?cadherin 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）Fig.5 Effects of proanthocyanidins on the protein expressions of TGF?β1 and E?cadherin in HeLa cells（， n＝3）

3.6 原花青素對Smad 蛋白表達(dá)的影響 原花青素對Smad2、Smad3 蛋白表達(dá)無明顯影響（P＞0.05），但對pSmad2、pSmad3 蛋白表達(dá)有抑制作用（P＜0.01），同時還可上調(diào)Smad7 蛋白表達(dá)（P＜0.01），并呈劑量依賴性。見圖6。

圖6 原花青素對Smad 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）Fig.6 Effects of proanthocyanidins on the protein expressions of Smads（， n＝3）

3.7 原花青素對E?cadherinmRNA 表達(dá)的影響加入10 μmol／L 抑制劑SB431542 后，E?cadherinmRNA 表達(dá)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；100 mg／L 原花青素干預(yù)后，E?cadherinmRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）。見圖7。

圖7 原花青素對E?cadherin mRNA 表達(dá)的影響（， n＝3）Fig.7 Effect of proanthocyanidins on the mRNA expression of E?cadherin（， n＝3）

4 討論

本實(shí)驗(yàn)為了避免宮頸癌細(xì)胞增殖帶來的實(shí)驗(yàn)誤差，采用了無血清培養(yǎng)基，并將實(shí)驗(yàn)控制在24 h。同時為了避免原花青素是由于產(chǎn)生抑制宮頸癌細(xì)胞而產(chǎn)生抑制侵襲遷移作用，采用了MTT 實(shí)驗(yàn)明確原花青素對宮頸癌細(xì)胞的用藥劑量，結(jié)果顯示原花青素質(zhì)量濃度在50 mg／L 以下時細(xì)胞抑制率較低，因此劃痕和Transwell 實(shí)驗(yàn)最終質(zhì)量濃度確定為50 mg／L（圖1）。用藥后12、24 h，在原花青素的作用下HeLa 細(xì)胞侵襲和遷移能力出現(xiàn)了不同程度的減弱，并呈時間依賴性（圖2～3）。

EMT 是指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變并獲得遷移能力的過程［7］。細(xì)胞失去極性，細(xì)胞的遷移和運(yùn)動能力增強(qiáng)，同時細(xì)胞表型發(fā)生改變，出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞的特性，導(dǎo)致細(xì)胞間連接松散，使腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的能力增強(qiáng)［8］。EMT 是腫瘤細(xì)胞獲得遷移能力的方式之一，它是腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移的重要途徑［9］。

EMT 形成的機(jī)制備受人們的關(guān)注，其中TGF?β 是被廣泛認(rèn)可的調(diào)控EMT 過程的重要蛋白［10］。其主要通過Smad 依賴型和非Smad 依賴型兩條信號通路調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子，參與EMT 的調(diào)控過程［11］。研究表明，TGF?β 是最早被發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT 過程發(fā)生的主要因素之一，其主要包括TGF?β1、TGF?β2、TGF?β3亞型，其中以TGF?β1 含量最高，與EMT 形成關(guān)系最為密切［12］。TGF?β1 在腫瘤細(xì)胞生長晚期可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其促癌的作用通常與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT 同步發(fā)生［13］。多項實(shí)驗(yàn)表明，腫瘤細(xì)胞里TGF?β1 的含量與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲正相關(guān)［14?15］。

E?cadherin 是維持上皮細(xì)胞極性和細(xì)胞間粘附的主要分子，其主要的功能是其可以形成蛋白復(fù)合體連接到肌動蛋白細(xì)胞骨架，阻止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲［16］，而EMT 可以使上皮細(xì)胞粘附分子及細(xì)胞骨架成分減少或消失從而獲得間質(zhì)細(xì)胞表型。因此，E?cadherin 表達(dá)減少或消失是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生EMT 的重要標(biāo)志［17］。

為了證明原花青素抑制宮頸癌侵襲和遷移的能力與EMT 有關(guān)，本研究采用了免疫熒光技術(shù)，半定量分析用藥前后宮頸癌細(xì)胞內(nèi)TGF?β1 和E?cadherin 的含量，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在藥物作用下，宮頸癌HeLa 細(xì)胞中的TGF?β1 均出現(xiàn)了不同程度的降低，呈濃度依賴（圖4）。為了進(jìn)一步觀察藥物作用與EMT 有關(guān)，同時也為了驗(yàn)證免疫熒光的結(jié)果，采用Western blot 檢測了TGF?β1 和E?cadherin 蛋白表達(dá)的水平，采用軟件進(jìn)行了定量分析。結(jié)果顯示原花青素可以降低TGF?β1 蛋白的含量，提高E?cadherin 蛋白含量，從而抑制宮頸癌EMT 的形成（圖5）。

此外，TGF?β／Smads 信號的激活與腫瘤密切相關(guān)，TGF?β／Smads 信號通路在腫瘤發(fā)生晚期可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、浸潤與轉(zhuǎn)移。Smad 蛋白是TGF?β1 受體的結(jié)合蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)TGF?β 信號的傳導(dǎo)［18］。可以分為以下3 類：受體結(jié)合的Smad（R?Smad）、Co?Smad（Smad4）和抑制 性Smad（I?Smads）。Smad2、Smad3 屬于受體結(jié)合的Smad［19］。TGF?β 與TGF?β 受體Ⅱ（TGF?βRⅡ）結(jié)合，可以磷酸化細(xì)胞內(nèi)下游轉(zhuǎn)錄因子Smad2 和Smad3，磷酸化的Smad2、Smad3 與Smad4 結(jié)合形成異源復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)并在核內(nèi)積累，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用［20］。Smad7 屬于TGF?β 受體拮抗蛋白，一旦激活后可以阻止Smad2／3 產(chǎn)生磷酸化，抑制Smad2／3 的活性，Smad7 可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)TGF?β 對胞核靶基因轉(zhuǎn)錄的影響，進(jìn)而抑制由TGF?β 信號引起的細(xì)胞產(chǎn)生的EMT 作用［21］。

為了找出原花青素抑制宮頸癌細(xì)胞EMT 的作用靶點(diǎn)，本研究通過Western blot 檢測了Smad 通路相關(guān)蛋白后發(fā)現(xiàn)，原花青素對HeLa 細(xì)胞沒有磷酸化的 Smad2、Smad3 沒有影 響，對磷酸 化Smad2、Smad3 蛋白產(chǎn)生了抑制作用，同時還可以上調(diào)Smad7 蛋白含量（圖6）。在聯(lián)合Smad 通路抑制劑SB431542 的作用下，原花青素對EMT 下游指標(biāo)E?cadherin的作用出現(xiàn)降低，提示原花青素可以通過Smad 通路抑制宮頸癌細(xì)胞EMT 的產(chǎn)生（圖7）。

綜上所述，原花青素在體外作用人宮頸癌HeLa 細(xì)胞可以通過下調(diào)TGF?β1 和上調(diào)E?cadherin蛋白含量抑制宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生EMT，進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲遷移能力。其作用機(jī)制與抑制TGF?β1 介導(dǎo)的Smad 依賴性通路中的Smad2／3 產(chǎn)生磷酸化，增強(qiáng)Smad7 蛋白含量有關(guān)。原花青素有望成為作為臨床宮頸癌化療的輔助用藥。