吳進(jìn)東，董欣華，朱旺生，張國(guó)星

（皖西學(xué)院，安徽 六安 237012）

霍山石斛屬蘭科石斛屬植物，產(chǎn)于大別山區(qū)安徽霍山及其鄰近地區(qū)，是我國(guó)名貴中藥［1］。石斛屬植物花中含有豐富的黃酮［2］，具有抗氧化、抗菌、抗炎、降血壓、清熱解毒等作用［3?5］，其提取方法主要包括水提［6］、堿提［7］、有機(jī)溶劑提取［8］、超聲波提?。??10］、超臨界流體提取［11］、酶輔助提取［12］等，但都具有一定局限性，而微波輔助提取是一種快速高效、安全環(huán)保的提取方法［13?18］。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)現(xiàn)有霍山石斛花總黃酮提取工藝存在的不足，采用微波輔助提取，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，以期為該藥材開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

UV?1800 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；UWave?2000 多功能微波合成萃取儀（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）；TDL?4 臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；中藥粉碎機(jī)（瑞安市百信藥機(jī)器械廠）。霍山石斛花由皖西學(xué)院植物園植物細(xì)胞功能中心提供，經(jīng)皖西學(xué)院陳存武教授鑒定為正品。蘆丁對(duì)照品（南京杜萊生物科技有限公司）。乙醇、NaOH、亞硝酸鈉、硝酸鋁等為分析純。

2 方法

2.1 原料預(yù)處理 參考葸玉琴等［8］報(bào)道的方法，霍山石斛花除雜后用蒸餾水洗凈，吸水紙吸干，置于105 ℃烘箱中殺青20 min，80 ℃下烘干至恒重，粉碎成粉末，過(guò)40 目篩，貯藏于干燥箱中備用。

2.2 總黃酮提取 參考葸玉琴等［8］報(bào)道的方法，準(zhǔn)確稱取1.0 g 粉碎的樣品，置于50 mL 三角瓶中，加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇進(jìn)行微波輔助提取，靜置冷卻后抽濾，加入相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗滌濾餅，合并濾液，離心，取上清液，紫外分光光度儀測(cè)定其吸光度。

2.3 線性關(guān)系考察 參考易建華等［12］報(bào)道的方法，精確稱取120 ℃下干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20 mg 左右，置于100 mL 量瓶中，60%乙醇溶解稀釋至刻度，精確量取25 mL，置于50 mL 量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得0.10 mg／mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于6 支10 mL 具塞試管中，加30% 乙醇至5 mL，精確加入5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min 后加入1 mol／L NaOH 溶液4 mL，加水0.4 mL，搖勻，放置15 min，以第一管為空白，于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），總黃酮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程為A＝9.176 9X－0.119 0（R2＝0.999 8）。

2.4 總黃酮提取量測(cè)定 取適量待測(cè)液于比色管中，按“2.3”項(xiàng)下回歸方程測(cè)定總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算提取量［10］，公式為提取量＝C×V×n／m，其中C表示待測(cè)液中總黃酮質(zhì)量濃度，V表示提取液總體積，n表示稀釋倍數(shù)，m表示樣品質(zhì)量。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波時(shí)間、微波溫度、液料比作為影響因素，水平分別為30%、45%、60%、75%、90%，1、2、3、4、5 min，50、60、70、80、90 ℃，20 ∶1、35 ∶1、50 ∶1、65 ∶1、80 ∶1，考察它們對(duì)總黃酮提取量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1～4。由此可知，各因素對(duì)總黃酮提取量都有明顯影響，而且均呈先升后降的趨勢(shì)，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)適宜水平在75% 左右，微波時(shí)間在2～4 min 之間，微波溫度在60～80 ℃之間，液料比在35 ∶1～80 ∶1 之間。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

圖2 微波時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of microwave time on extraction yield of total flavonoids

圖3 微波溫度對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of microwave temperature on extraction yield of total flavonoids

圖4 液料比對(duì)總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of liquid?solid ratio on extraction yield of total flavonoids

3.2 響應(yīng)面法 在“3.1”項(xiàng)下結(jié)果基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法作進(jìn)一步優(yōu)化，設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）水平分別為50%、65%、80%，微波時(shí)間（B）水平分別為2、3、4 min，微波溫度（C）水平分別為55、70、85 ℃，液料比（D）水平分別為40 ∶1、55 ∶1、70 ∶1，總黃酮提取量（Y）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表1。

對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn) 行擬合，得到方程為Y＝－96.436 167＋1.707 156A＋8.960 333B＋0.619 467C＋0.559 756D－ 0.022 000AB－ 0.016 222AC＋0.000 044AD＋ 0.010 667BC－ 0.006 333BD－0.002 766CD－ 0.011 487A2－ 1.299 500B2－0.002 642C2－0.003 020D2，方差分析見(jiàn)表2。由此可知，模型影響顯著（P＜0.01），失擬度不顯著（P＞0.05），表明其擬合度高；決定系數(shù)R2＝0.955 3，＝0.910 6，變異系數(shù)CV ＝4.28%＜5%，表明該模型重復(fù)性好；各因素影響程度依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波溫度＞料液比＞微波時(shí)間，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)極顯著（P＜0.01），微波溫度、液料比顯著（P＜0.05），微波時(shí)間不顯著（P＞0.05）。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.1 Design and results of tests

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

通過(guò)Design expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。由此可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波時(shí)間、微波溫度、液料比增加，總黃酮提取量均呈先升后降的趨勢(shì)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波溫度、液料比更明顯（P＜0.05），與單因素試驗(yàn)結(jié)果吻合；微波溫度與液料比的響應(yīng)面最陡峭，說(shuō)明兩者有顯著互作效應(yīng)，與方差分析結(jié)果一致。最終確定，最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)66.30%，液料比56.37 ∶1，微波溫度73.64 ℃，微波時(shí)間3.05 min，總黃酮提取量12.41 mg／g，考慮到操作方便，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)66%，液料比56 ∶1，微波溫度74 ℃，微波時(shí)間3 min。按上述優(yōu)化工藝進(jìn)行6 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得總黃酮平均提取量為12.23 mg／g，與預(yù)測(cè)值12.41 mg／g 接近（相對(duì)誤差為1.45%），表明該工藝穩(wěn)定可行。

圖5 各因素響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for various factors

4 討論

近年來(lái)，微波輔助技術(shù)因其具有加熱均勻、省時(shí)高效、節(jié)能環(huán)保、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，在提取植物黃酮類物質(zhì)中被廣泛應(yīng)用。微波輻射能改變提取液中極性分子的取向，活化黃酮分子，使其更易于提?。?9］，當(dāng)乙醇與提取物質(zhì)極性越接近時(shí)，提取物析出量越大，而前者極性與其體積分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)［20］。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)在75%左右較適宜，此時(shí)溶液極性與總黃酮極性接近，可使提取量最高；微波時(shí)間、微波溫度分別在2～4 min，60～80 ℃之間較適宜，微波輻射可使細(xì)胞內(nèi)部溫度迅速上升，破壞細(xì)胞壁及內(nèi)部結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)活性成分更容易溶出，從而提高黃酮提取效率［20］；在一定范圍內(nèi)，總黃酮溶出量隨著微波時(shí)間延長(zhǎng)、微波溫度增加而升高，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高時(shí)其結(jié)構(gòu)易被破壞，同時(shí)雜質(zhì)溶出率增加［9］；液料比在30～80 倍之間較適宜，在一定范圍內(nèi)其數(shù)值越大，黃酮越容易被充分溶解出來(lái)，提取率也越高，但過(guò)大時(shí)雜質(zhì)溶出也會(huì)增加［9］。最終確定，霍山石斛花總黃酮最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)66%，微波時(shí)間3 min，微波溫度74 ℃，液料比56 ∶1，總黃酮提取量為12.23 mg／g。