卜凡淑，牛 陽(yáng)，張 婷，黃楷迪，錢大瑋，段金廒

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210023； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川750004； 3.中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023）

隨著生活壓力的加大、老年人口的增多，記憶力減退已成為影響人們生活質(zhì)量的重要因素。八珍益智方來(lái)源于《成方便讀》，具有增強(qiáng)智力、延緩衰老、提高記憶力的功效［1］，由龍眼肉、益智仁、陳皮、炙甘草、茯苓、白術(shù)、蓮子肉、山藥組成。近年來(lái)，八珍益智方在制備工藝、藥理活性方面的研究取得了一定進(jìn)展［2?3］，但尚無(wú)其整方給藥在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物分析及過(guò)程考察。

藥物進(jìn)入體內(nèi)后，通常會(huì)產(chǎn)生一種或多種代謝產(chǎn)物，對(duì)其研究有助于闡明體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)［4］。高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜（LC?MS／MS）法因其高靈敏度、高選擇性，被廣泛應(yīng)用于中藥代謝產(chǎn)物的考察中，通過(guò)結(jié)合基于質(zhì)量虧損濾過(guò)為基礎(chǔ)的代謝物尋找軟件來(lái)尋找目標(biāo)代謝物，再進(jìn)一步對(duì)目標(biāo)代謝物進(jìn)行MS／MS 分析，可快速推測(cè)復(fù)雜生物基質(zhì)中的代謝產(chǎn)物［5］。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜?線性離子阱?靜電軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC?LTQ?Orbitrap?MS）法，分析大鼠灌胃給予八珍益智方后血漿、膽汁、尿液、糞便中的非揮發(fā)性成分及代謝產(chǎn)物，以期為該方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 材料

UltiMate 3000 型超高效液相色譜儀、LTQ?Orbitrap Velos Pro 質(zhì)譜儀、Xcalibur 3.0 質(zhì)譜工作站軟件、Metworks 1.3 及Mass Frontier 7.0 分析軟件（美國(guó)Thermo 公司）；Anke GL?16G II 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；WH?微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；ML204、MS105電子天平［梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］。

異甘草苷（R07D8F50056）、異甘草素（C03A8Q41092）、桔皮素（H09M7K14409）、橙皮素（C03F6Y1）、茯苓新酸A（150417）、白楊素（X24O6C4947）對(duì)照品均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%。龍眼肉、茯苓、益智仁、陳皮、炙甘草、山藥、白術(shù)、蓮子肉由安徽省亳州市紫銳藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝副教授鑒定為正品，符合2020 年版《中國(guó)藥典》 要求，具體見表1。甲酸、甲醇、乙腈為色譜純（德國(guó)Merck 公司）；超純水由Milli?Q 純水機(jī)制備。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

清潔級(jí)雄性SD 大鼠，約8 周齡，體質(zhì)量（220±10）g，由北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)SCXK（京）2016?0006。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度（45±10）%。

2 方法

2.1 檢測(cè)條件 ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫（0～7 min，0～5%A；7～12 min，5%～15% A；12～16 min，15%～35% A；16～22 min，35%～45% A；22～25 min，45%～70% A；25～27 min，70%～90% A；27～28 min，90%～100%A；28～30 min，100%A）；體積流量0.4 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL。電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子掃描模式，掃描范圍m／z50～1 000；采集時(shí)間0.8～30 min；毛細(xì)管溫度350 ℃；蒸發(fā)器溫度350 ℃；鞘氣流40 kPa；輔助氣流15 kPa；噴霧電壓3.5 V；源電流100 μA；MS2質(zhì)譜的觸發(fā)方式為動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)依賴分析模式。

2.2 供試品溶液制備 各單味藥材飲片分別按八珍益智方日用處方量稱取，混合均勻后加水回流提取2 次，第1 次按料液比1 ∶12 用水蒸氣蒸餾法提取6 h，收集揮發(fā)油，過(guò)濾提取液，第2 次按料液比1 ∶10 同法提取2 h，過(guò)濾提取液，合并濾液，減壓濃縮后制成生藥量為1.40 g／mL，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取異甘草苷、異甘草素、桔皮素、橙皮素、白楊素、茯苓新酸A 對(duì)照品適量，甲醇制成1 mg／mL 溶液，即得。

2.4 分組與給藥 24 只大鼠隨機(jī)分為空白組和給藥組，每組12 只（血漿組、膽汁組、尿液／糞便組各4 只），給藥組大鼠灌胃給予八珍益智方水煎液，劑量為13.95 g／kg，加入揮發(fā)油混合均勻，連續(xù)3 d，每天1 次；空白組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水。

2.5 生物樣品采集 大鼠最后1 次給藥前禁食不禁水12 h，其中血漿組大鼠于給藥后0.5、1、2、4、6、8 h 眼眶靜脈叢取血各0.5 mL，置于預(yù)先涂有1%肝素鈉生理鹽水的EP 管中，4 000 r／min 離心10 min，取上清，即得血漿樣品；膽汁組大鼠用10%水合氯醛麻醉，插入膽管并固定，給藥后收集10 h 內(nèi)膽汁；尿液／糞便組大鼠收集36 h 內(nèi)尿液／糞便，每12 h 1 次。樣品均置于－80 ℃下保存。

2.6 生物樣品處理

2.6.1 血漿 將大鼠各時(shí)間點(diǎn)血漿樣品等體積合并，以消除個(gè)體差異性。取300 μL 血漿樣品，加入3 倍量甲醇沉淀蛋白，渦旋30 s，12 000 r／min離心10 min，取上清液離心濃縮，加入0.1%甲酸、甲醇各50 μL 復(fù)溶，12 000 r／min 離心10 min，取上清液。

2.6.2 膽汁 取大鼠各時(shí)間點(diǎn)混合膽汁樣品200 μL，加入200 μL 甲醇渦旋30 s，12 000 r／min離心10 min，取上清液。

2.6.3 尿液 取大鼠各時(shí)間點(diǎn)混合尿液樣品500 μL，加入500 μL 甲醇渦旋30 s，12 000 r／min離心10 min，取上清液，離心濃縮，加入200 μL 0.1%甲酸復(fù)溶，12 000 r／min 離心10 min，取上清液。

2.6.4 糞便 將大鼠不同時(shí)間點(diǎn)糞便按質(zhì)量比混合，取0.5 g，加1.5 mL 50%甲醇超聲處理30 min，上清液渦旋30 s，12 000 r／min 離心10 min，取上清液。

3 結(jié)果

3.1 UHPLC?LTQ?Orbitrap?MS 分析通過(guò)MetWorks代謝物鑒定軟件中的質(zhì)量虧損過(guò)濾功能，除去基質(zhì)中的信號(hào)干擾，結(jié)合對(duì)照品及參考文獻(xiàn)中的保留時(shí)間，一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息，共得到46 種成分，其中原型6 種，代謝產(chǎn)物40 種。提取離子流圖見圖1～2。

圖1 正離子模式下提取離子流圖Fig.1 Extracted ion current chromatograms in positive ion mode

以八珍益智方水提液前期分析為基礎(chǔ)，確定其主要成分為黃酮、三萜酸、三萜皂苷。藥物的氧化代謝產(chǎn)物及部分結(jié)合代謝產(chǎn)物質(zhì)量虧損值近似于母藥，但某些代謝反應(yīng)的質(zhì)量虧損會(huì)具有明顯變化，如母藥分子產(chǎn)生裂解反應(yīng)、谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)、脫烷基代謝產(chǎn)物等。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)這一規(guī)律，根據(jù)取代基的種類和數(shù)量設(shè)定參數(shù)，見表2。

圖2 負(fù)離子模式下提取離子流圖Fig.2 Extracted ion current chromatograms in negative ion mode

表2 質(zhì)量虧損參數(shù)Tab.2 Parameters for mass defects

將質(zhì)量虧損設(shè)置為較寬范圍進(jìn)行初步篩選，雖然基質(zhì)干擾離子在一定程度上會(huì)相應(yīng)增加，但也可發(fā)現(xiàn)更多目標(biāo)及非目標(biāo)化合物，再結(jié)合ppm 小于1.0×10－5的條件尋找符合代謝修飾的代謝產(chǎn)物準(zhǔn)分子離子峰，依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道、二級(jí)質(zhì)譜碎片離子分析代謝物結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)Mass Frontier 7.0 譜圖解析軟件作進(jìn)一步驗(yàn)證，即可得到各類化合物相應(yīng)代謝物。以糞便樣品正離子檢測(cè)模式為例，其總離子流圖和經(jīng)質(zhì)量虧損過(guò)濾后的總離子流圖見圖3，可知經(jīng)質(zhì)量虧損過(guò)濾后的TIC 基線更平穩(wěn)，色譜峰也有所增強(qiáng)。

圖3 糞便樣品在正離子模式下（A）、經(jīng)質(zhì)量虧損過(guò)濾后總離子流圖（B）Fig.3 Total ion current chromatograms of stool sample in positive ion mode（A）and after mass defect filtering（B）

3.2 代謝產(chǎn)物分析

3.2.1 異甘草苷（A）、異甘草素（B）共鑒定出4 個(gè)異甘草苷代謝產(chǎn)物、10 個(gè)異甘草素代謝產(chǎn)物，具體見表3、圖4。其中，異甘草苷的主要碎片離子m／z255，為異甘草苷脫去一分子葡萄糖產(chǎn)生的碎片離子，也是異甘草素的特征分子離子峰；異甘草素屬查爾酮類衍生物，2 個(gè)苯環(huán)之間有3 個(gè)碳原子相連，其中2 個(gè)碳原子由α、β?不飽和碳構(gòu)成，易發(fā)生RDA 裂解產(chǎn)生m／z135、119、91 的特征碎片離子。A0 是異甘草苷，保留時(shí)間為16.80 min，負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m／z417.115 5 ［M?H］－，具有m／z255 的特征碎片離子，進(jìn)一步脫一分子C8H8O 產(chǎn)生m／z135.066 3 的碎片，與對(duì)照品相符；代謝物A1、A2、A3 的準(zhǔn)分子離子峰分別為m／z433.110 9、449.105 8、497.072 4，比異甘草苷大16、32、80，而且都具有255 的特征碎片離子，推測(cè)為異甘草苷單氧化、雙氧化和硫酸化產(chǎn)物；A4 比A1 大80，推測(cè)為異甘草苷氧化硫酸化產(chǎn)物。

圖4 異甘草苷（A）、異甘草素（B）代謝途徑Fig.4 Metabolic pathways of isoliquiritin（A）and isoliquiritigenin（B）

表3 異甘草苷、異甘草素代謝產(chǎn)物Tab.3 Metabolites of isoliquiritin and isoliquiritigenin

在體內(nèi)代謝過(guò)程中，異甘草苷結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵易于水解丟失葡萄糖而形成苷元，代謝物B0 分子量較異甘草苷少162，保留時(shí)間為20.04 min，準(zhǔn)分子離子峰為m／z255.066 9 ［M?H］－，在MS／MS圖譜上觀察到m／z135、119、91 的碎片離子，與對(duì)照品相符，鑒定為異甘草素；代謝物B1、B2 分子量分別比異甘草素大57、119，推測(cè)其為異甘草素甘氨酸和半胱氨酸結(jié)合產(chǎn)物；B3、B6、B8 分子量分別比 異甘草素大16、32、48，具 有m／z135.066 3 的特征碎片，推測(cè)為異甘草素單氧化、雙氧化、三氧化產(chǎn)物；B4、B7 分子量分別比B3、B6 大80，可能為后者硫酸化產(chǎn)物；B5 分子量比B3 大176，具有m／z255、135 的特征碎片，推測(cè)為異甘草素的氧化醛酸化產(chǎn)物；B9、B10 分子量比異甘草素大176、256，可能為醛酸化、醛酸化加硫酸化產(chǎn)物；B11 分子量比異甘草素大2，具有m／z135、91 的特征碎片，推測(cè)為異甘草素的還原產(chǎn)物。Ⅱ相反應(yīng)（如葡萄糖醛酸化、硫酸化）為異甘草素主要代謝途徑，與文獻(xiàn)［6?8］ 報(bào)道一致。

3.2.2 白楊素（C）共鑒定出4 個(gè)白楊素代謝產(chǎn)物，具體見表4、圖5。其中，C0 保留時(shí)間為22.34 min，正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m／z255.063 5 ［M＋H］＋，具有m／z153.018 2 的特征碎片離子，與對(duì)照品相符，鑒定為白楊素；C1 準(zhǔn)分子離子峰為m／z335.004 7 ［M＋H］＋，比白楊素大80，而且有m／z255 的碎片離子，推測(cè)為白楊素的硫酸化產(chǎn)物；C2 分子量比白楊素大176，推測(cè)為白楊素的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物［9］；C3 分子量比白楊素大16，具有m／z255、153 的碎片，可能為白楊素的羥基化產(chǎn)物；C4 分子量比白楊素大14，可能為甲基化產(chǎn)物，雖然白楊素的7′?OH 甲基化為楊芽黃素，但C4 與其對(duì)照品保留時(shí)間不一致，故甲基化反應(yīng)發(fā)生在5′?OH。

3.2.3 茯苓新酸A（D）共鑒定出4 個(gè)茯苓新酸A 代謝產(chǎn)物，具體見表4、圖5。其中，D0 是茯苓新酸A，保留時(shí)間為27.15 min，正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m／z499.341 4 ［M ＋H］＋，m／z463.320 7為脫兩分子H2O 產(chǎn)生的碎片，與對(duì)照品相符；D1 為D0 的脫甲基產(chǎn)物，m／z411.315 6 為其脫一分子C3H6O2產(chǎn)生的碎片；D2 分子量比D1大80，可能D1 的硫酸化產(chǎn)物；D3 分子量比D0 小2，m／z479.315 6 為脫水產(chǎn)生的碎片，推測(cè)為茯苓新酸A 的脫氫產(chǎn)物；D4 分子量比D1 大2，m／z413.315 6為脫C3H6O2的碎片，推測(cè)為茯苓新酸A 脫甲基后的還原產(chǎn)物。上述代謝途徑與文獻(xiàn)［10］ 報(bào)道一致。

3.2.4 橙皮素（E）共鑒定出5 個(gè)橙皮素代謝產(chǎn)物，具體見表4、圖5。其中，E0 是橙皮素，保留時(shí)間為19.15 min，正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m／z303.087 7 ［M＋H］＋，m／z285.075 7 為脫一分子H2O 碎片，m／z177.054 6 為橙皮素脫一分子C6H6O3產(chǎn)生的特征離子碎片，與對(duì)照品相符；E1、E2 分子量分別比橙皮素大80、176，均含有m／z303、153 的碎片，推測(cè)分別為橙皮素的硫酸化、醛酸化結(jié)合產(chǎn)物；E3 分子量比橙皮素大14，推測(cè)為橙皮素的甲基化產(chǎn)物；E4 分子量比橙皮素小14，具有m／z135 的離子碎片，可能為橙皮素的脫甲基產(chǎn)物；E5 比橙皮素小30，具有m／z153 的碎片，可能為橙皮素的脫甲氧基產(chǎn)物［11?12］。

圖5 白楊素（C）、茯苓新酸A（D）、橙皮素（E）代謝途徑Fig.5 Metabolic pathways of chrysin（C），poricoic acid A（D）and hesperetin（E）

表4 白楊素、茯苓新酸A、橙皮素代謝產(chǎn)物Tab.4 Metabolites of chrysin，poricoic acid A and hesperetin

3.2.5 桔皮素（F）共鑒定出12 個(gè)桔皮素代謝產(chǎn)物，具體見表5、圖6。其中，F(xiàn)0 是桔皮素，保留時(shí)間為24.06 min，正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m／z373.125 5 ［M＋H］＋，m／z358.104 7 為脫一分子CH3碎片，m／z343.117 6 為進(jìn)一步脫CH3碎片，與對(duì)照品相符；F1?1、F1?2、F1?3 分子量比桔皮素小14，保留時(shí)間不一致，但都具有m／z344 脫甲基碎片，推測(cè)為桔皮素不同位點(diǎn)的脫甲基反應(yīng)；F2、F3、F4 分子量分別比F1 大16、80、176，可能為桔皮素脫甲基使酚羥基暴露從而進(jìn)一步發(fā)生羥基化、硫酸化、醛酸化結(jié)合反應(yīng)；F5、F6 分子量分別比F2 大80、176，可能為桔皮素脫甲基后發(fā)生羥基硫酸化和羥基醛酸化的多步代謝反應(yīng)；F7分子量比桔皮素小28，均具有脫一分子CH3的m／z330.073 4 碎片離子，推測(cè)為桔皮素不同位點(diǎn)的雙脫甲基反應(yīng)；F8 分子量比F7 大16，可能為桔皮素雙脫甲基后的羥基化代謝物；F9 分子量比桔皮素小36，可能為桔皮素的三脫甲基產(chǎn)物。上述代謝途徑與文獻(xiàn)［13］ 報(bào)道一致。

圖6 桔皮素（F）代謝途徑Fig.6 Metabolic pathway of tangeretin（F）

表5 桔皮素代謝產(chǎn)物Tab.5 Metabolites of tangeretin

4 討論與結(jié)論

異甘草苷在大鼠體內(nèi)主要生成脫葡萄糖基的苷元異甘草素，進(jìn)而發(fā)生一系列II 相結(jié)合反應(yīng)。代謝物在膽汁中較少，大多見于尿液、糞便中，說(shuō)明膽汁排泄不是異甘草素在大鼠體內(nèi)的主要排泄途徑［14］；在尿液、糞便中可檢測(cè)到白楊素原型存在，但共同成分——楊芽黃素可去甲基形成白楊素，故并不能排除部分白楊素是由該成分脫甲基轉(zhuǎn)化而來(lái)。本實(shí)驗(yàn)中水提液提取時(shí)間為6 h，在長(zhǎng)時(shí)間高溫煎煮下，小極性化合物被少量提取出來(lái)，在糞便中檢測(cè)出3 種代謝產(chǎn)物［10］。前期發(fā)現(xiàn)，八珍益智方水提取物中橙皮苷含量很高，但大鼠體內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)其原型物；文獻(xiàn)［15］ 報(bào)道，橙皮苷在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為橙皮素后被吸收，但本實(shí)驗(yàn)僅在血漿、尿液中檢測(cè)到橙皮素原型和代謝物。桔皮素雖無(wú)游離的酚羥基結(jié)構(gòu)，但在體內(nèi)容易通過(guò)Ⅰ相代謝酶的催化，將甲氧基轉(zhuǎn)化為羥基進(jìn)而發(fā)生Ⅱ相代謝反應(yīng)。多甲氧基黃酮類化合物的代謝物比原型具有更好的抗炎活性［16］，故桔皮素在體內(nèi)的主要代謝通路為去甲基，其主要代謝物大多分布在膽汁、尿液中。

八珍益智方中龍眼肉、山藥主要成分為多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸，蓮子肉主要成分為蛋白質(zhì)、淀粉，白術(shù)主要成分為多糖、揮發(fā)油、內(nèi)酯，但無(wú)法確定蛋白質(zhì)、多糖代謝產(chǎn)物；內(nèi)酯在藥材中含量較低，或吸收進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)代謝、分布、排泄等而在血、尿中含量很低，導(dǎo)致超出儀器檢測(cè)限而無(wú)法測(cè)得，具體仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn) 首次利 用UHPLC?LTQ?Orbitrap?MS 法對(duì)大鼠灌胃給予八珍益智方后非揮發(fā)性成分的體內(nèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，可為進(jìn)一步探討該方體內(nèi)過(guò)程、闡明其功效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。