姚嘉明 劉彬彬 葉 蔚 楊一天 王晶磊 王小奇

1 杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

2 浙江省榮軍醫(yī)院 浙江 嘉興 314000

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）主要病理改變?yōu)槔奂敖Y(jié)直腸黏膜的慢性非特異性炎癥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)仍缺乏特效治愈方法。第二批全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承工作指導(dǎo)老師俞尚德先生從醫(yī)70余年來專攻消化系統(tǒng)疾病，其創(chuàng)制的俞氏灌腸方用于臨床治療該病頗有良效。本研究團隊在前期實驗研究中，已證實該方對TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠具有明確的治療作用[1]。此次研究乃進(jìn)一步通過免疫實驗檢測各組大鼠結(jié)腸黏膜β-arrestin1/2、δ阿片受體（DOR）、Bcl-2、NF-κB蛋白表達(dá)水平，探索其可能的療效機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：60只清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量介于160～190g，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，均由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（滬）2013-0016。飼養(yǎng)場所通風(fēng)良好，溫度維持于18～22℃，濕度維持于45%～65%。

1.2 藥物的配制：按處方（黃芩、丹參、蒲公英、紅藤、敗醬草、半邊蓮、半枝蓮、薏苡仁）以3∶3∶3∶3∶3∶2∶2∶2比例取定量藥材（杭州市中醫(yī)院中藥房提供），根據(jù)成人等效劑量折算后，以20g·kg-1?d-1為低劑量組，40g·kg-1?d-1為中劑量組，80g·kg-1?d-1為高劑量組，每劑制備濃煎液2ml。美沙拉嗪（法國愛的發(fā)制藥公司提供）研細(xì)加入蒸餾水中搖勻，制成0.3g/kg混懸液。

1.3 模型建立及分組處理：60只大鼠隨機分為6組，正常組、模型組、復(fù)方低、中、高劑量組及美沙拉嗪組，每組10只。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后禁食不禁水24小時，腹腔注射麻醉，將直徑2mm、長約12cm的硅膠軟管從大鼠肛門插入約8cm，除正常組外，將30mg三硝基苯磺酸（TNBS）(0.6ml，由美國SIGMA公司提供)的50%乙醇(0.25ml)溶液0.85ml快速注入，正常組以同體積蒸餾水代替注入。注入后立即捏緊肛門，提起鼠尾倒置約5min，待其麻醉清醒后正常喂養(yǎng)。造模后次日起各組開始藥物灌腸，1次/日，共10天。其中正常組、模型組每日灌注蒸餾水2ml；復(fù)方各劑量組分別灌注不同劑量復(fù)方中藥藥汁2ml；美沙拉嗪組灌注美沙拉嗪混懸液2ml。實驗過程中，復(fù)方3組各有1只大鼠因灌腸時操作不當(dāng)出現(xiàn)腸穿孔死亡，模型組及復(fù)方3組共5只大鼠在開始給藥治療后1周內(nèi)因疾病并發(fā)腸梗阻死亡。各組大鼠在實驗結(jié)束后全部處死，迅速剖取結(jié)腸，自肛門以上2cm處向上取結(jié)腸6～8cm，沿腸系膜縱軸剪開腸腔，用生理鹽水沖洗干凈，剪取病變最明顯的結(jié)腸標(biāo)本（2cm左右），用4%多聚甲醛固定，逐級酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋待用。

1.4 檢測指標(biāo)：結(jié)腸組織δ阿片受體（DOR）、β-arrestin1、β-arrestin2、Bcl-2、NF-κB蛋白表達(dá)，采用免疫組織化學(xué)二步法檢測。免疫組化結(jié)果評定：在顯微鏡下觀察免疫組化結(jié)果，黃色或棕黃色染色即陽性表達(dá)，藍(lán)色染色即陰性表達(dá)。用圖像分析軟件Image-Pro-Plus6.0進(jìn)行圖像分析，測定積分光密度(IOD)和目標(biāo)區(qū)域面積（area），計算得出平均光密度值（meandensity）作為免疫組化結(jié)果，計算公式為Density(mean)=IOD/area。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

各組大鼠結(jié)腸組織DOR、β-arrestin1、β-arrestin2、Bcl-2、NF-κB蛋白表達(dá)情況，詳見表1。模型組大鼠結(jié)腸組織中DOR、β-arrestin1、Bcl-2、NF-κB蛋白表達(dá)較正常組明顯升高，β-arrestin2蛋白表達(dá)則明顯下降（P＜0.01）；復(fù)方低、中、高劑量組及美沙拉嗪組DOR、β-arrestin1、Bcl-2、NF-κB蛋白表達(dá)較模型組明顯下降（P＜0.01），復(fù)方中、高劑量組及美沙拉嗪組β-arrestin2蛋白表達(dá)則較模型組明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 各組大鼠結(jié)腸DOR、β-arrestin1、β-arrestin2、Bcl-2及NF-κB蛋白的表達(dá)（±s，平均光密度值）

表1 各組大鼠結(jié)腸DOR、β-arrestin1、β-arrestin2、Bcl-2及NF-κB蛋白的表達(dá)（±s，平均光密度值）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。

分組正常組模型組復(fù)方低劑量組復(fù)方中劑量組復(fù)方高劑量組美沙拉嗪組例數(shù)10 9 7 8 8 1 0 DOR 0.0292±0.0005 0.0809±0.0004ΔΔ 0.0682±0.0005**ΔΔ 0.0489±0.0005**ΔΔ 0.0318±0.0002**ΔΔ 0.0315±0.0002**ΔΔ β-arrestin1 0.0550±0.0031 0.1367±0.0069ΔΔ 0.1115±0.0006**ΔΔ 0.0804±0.0007**ΔΔ 0.0661±0.0015**Δ 0.0740±0.0026**ΔΔ β-arrestin2 0.0792±0.0306 0.0209±0.0076ΔΔ 0.0342±0.0102Δ 0.0424±0.0130*0.0768±0.0178**0.0501±0.0173**Bcl-2 0.0381±0.0019 0.0890±0.0022ΔΔ 0.0624±0.0008**ΔΔ 0.0515±0.0015**ΔΔ 0.0411±0.0007**0.0422±0.0014**NF-κB 0.0079±0.0040 0.0537±0.0150ΔΔ 0.0130±0.0021**0.0128±0.0032**0.0062±0.0029**0.0082±0.0036**

3 討論

中醫(yī)藥治療UC具有獨特的優(yōu)勢，但多缺乏療效及機制驗證研究。俞老認(rèn)為UC的病機以濕熱蘊腸、氣滯絡(luò)瘀為標(biāo)，脾虛失健為本，活動期以標(biāo)實為主，據(jù)此創(chuàng)制的俞氏灌腸方在治療中常能取得良效。該方具清熱解毒、活血化瘀、健脾化濕、消腫生肌之功。筆者前期研究已證實該方對UC模型大鼠具有明確的治療作用[1]。

G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)是至今所發(fā)現(xiàn)的最大的細(xì)胞表面受體家族，負(fù)責(zé)把細(xì)胞外信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)。βarrestin是GPCR相關(guān)信號通路中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)銜接蛋白，可調(diào)節(jié)GPCR受體的功能。其有β-arrestin1/2兩個亞型，在細(xì)胞凋亡和活化等過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，UC發(fā)生時T細(xì)胞活化的CD28共刺激信號誘導(dǎo)T細(xì)胞表達(dá)δ阿片受體（DOR），后者誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞漿內(nèi)的β-arrestin1轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)并促進(jìn)Bc1-2基因轉(zhuǎn)錄和Bc1-2蛋白表達(dá)，從而抑制CD4+T細(xì)胞凋亡而使其過度增強致黏膜免疫穩(wěn)態(tài)喪失[3]。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織DOR、β-arrestin1、Bcl-2表達(dá)較正常組明顯升高（P＜0.01），俞氏灌腸方各劑量組其表達(dá)較模型組明顯減少（P＜0.01），說明俞氏灌腸方可通過抑制DOR、β-arrestin1和Bcl-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的凋亡。另一方面，目前研究已證實NF-κB在UC腸黏膜炎性細(xì)胞活化過程中具有核心地位，抑制其表達(dá)及活化是治療的重要策略。β-arrestin2可通過結(jié)合IκBα和IKK，抑制CK2和IKK對IκBα的磷酸化，減弱NF-κB的活化，從而減輕腸黏膜炎癥反應(yīng)[4]。本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織NF-κB表達(dá)明顯升高，β-arrestin2表達(dá)明顯下降（P＜0.01）；與模型組比較，俞氏灌腸方各劑量組NF-κB表達(dá)明顯下降（P＜0.01），復(fù)方中、高劑量組β-arrestin2蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。該結(jié)果說明俞氏灌腸方可通過上調(diào)β-arrestin2蛋白的表達(dá)抑制NF-κB的表達(dá)和活化，從而減輕了腸道炎癥反應(yīng)。綜上所述，俞氏灌腸方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制可能是通過影響β-arrestin的相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá)促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的凋亡并抑制NF-κB的表達(dá)、活化，從而減輕了腸道炎癥反應(yīng)對結(jié)腸的損傷，有助于恢復(fù)腸黏膜的免疫穩(wěn)態(tài)。