鄧艷芹,汪坤乾,邱 收,梁 翰

(武漢農(nóng)業(yè)檢測(cè)中心，湖北 武漢 430016)

孔雀石綠(malachite green, MG)是一種帶有金屬光澤的綠色結(jié)晶體,不僅作為一種工業(yè)性染料,還因?yàn)閮r(jià)格低廉且具有殺真菌的作用,曾被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖上.孔雀石綠屬三苯甲烷類(lèi),能引起動(dòng)物肝臟組織、腎、心臟、披、肺、眼睛、皮膚等臟器和組織中毒,且在動(dòng)物組織中殘留性較高.在動(dòng)物臟器中,孔雀石綠還能通過(guò)生物轉(zhuǎn)化,還原代謝成脂溶性的隱色孔雀石綠(leucomalachite green, LMG),具有高毒性、高殘留和致癌、致畸、致突變作用.這些含有孔雀石綠及其代謝物殘留的水產(chǎn)品被食用后,會(huì)嚴(yán)重威脅人類(lèi)身體健康[1].由于缺乏有效的替代物以及利益驅(qū)使,孔雀石綠的違禁使用仍然時(shí)有發(fā)生.

作為全面開(kāi)展水產(chǎn)品食品安全監(jiān)管的項(xiàng)目之一,如何快速和準(zhǔn)確地檢測(cè)孔雀石綠是各大檢測(cè)機(jī)構(gòu)普遍關(guān)注的問(wèn)題.目前,采用液質(zhì)聯(lián)用儀方法對(duì)孔雀石綠及其代謝物進(jìn)行檢測(cè)是常用的檢測(cè)手段[2-4].日常監(jiān)測(cè)中,通常采用GB/T19857-2005水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定[5]中推薦的方法進(jìn)行檢測(cè),但是該方法步驟繁瑣,且經(jīng)過(guò)了多次轉(zhuǎn)移、定容以及氮吹操作,導(dǎo)致回收率不穩(wěn)定,對(duì)操作人員專(zhuān)業(yè)性要求較高.本研究旨在研究如何應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用儀快速準(zhǔn)確地對(duì)水產(chǎn)品中孔雀石綠進(jìn)行檢測(cè),以滿(mǎn)足日?？焖贆z測(cè)水產(chǎn)品的要求.

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

乙腈(CH3CN,色譜純,美國(guó)J.T.Baker公司);甲醇(CH3OH,色譜純,美國(guó)J.T.Baker公司);中性氧化鋁柱(ANPEL, 500 mg/3 mL);50 mL聚乙烯離心管;乙酸銨(優(yōu)級(jí)純);甲酸(色譜純);孔雀石綠及隱色孔雀石綠純度>95%,購(gòu)自北京農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所;孔雀石綠-D5和隱色孔雀石綠-D6分別作為內(nèi)標(biāo)，購(gòu)自北京農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所;氯化鈉(NaCl,分析純).

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo quantum access,賽默飛世爾科技有限公司,ESI源);旋渦震蕩儀(XH-D);超聲儀(20 kHz～40 kHz);分析天平(精確到百分位).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本研究做了以下幾組對(duì)照試驗(yàn).

提取劑乙腈添加體積為25 mL和10 mL兩組對(duì)照.首先作為對(duì)照,按照國(guó)標(biāo)法,添加乙腈體積為25 mL,分取10 mL凈化后,氮吹并定容到2 mL.接著,本方法采用減少乙腈體積至10 mL進(jìn)行對(duì)比.即稱(chēng)取5.00 g樣品后,加入10 mL乙腈,添加3 g氯化鈉后,渦旋振蕩3 min,超聲30 min,12000 r/min離心3 min.取1.5 mL進(jìn)行過(guò)中性氧化鋁柱凈化,并上機(jī).通過(guò)添加5.0 μg/kg、10.0 μg/kg、20.0 μg/kg三個(gè)不同濃度梯度,每個(gè)梯度三個(gè)平行,比較兩種方法的操作難易程度及回收率.

添加NaCl和不添加NaCl對(duì)照試驗(yàn).對(duì)6個(gè)草魚(yú)樣品添加濃度為20 μg/kg的孔雀石綠和隱色孔雀石綠,分為添加NaCl和不添加NaCl兩個(gè)樣品組,每組三個(gè)平行,其他實(shí)驗(yàn)操作保持一致,進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)對(duì)比.

凈化方法選擇對(duì)比.對(duì)6個(gè)草魚(yú)樣品添加濃度為20 μg/kg的孔雀石綠和隱色孔雀石綠進(jìn)行回收對(duì)比試驗(yàn).采用乙腈提取和添加NaCl并離心的方法,吸取上清液作為提取液.將進(jìn)行提取操作后的6個(gè)平行樣分為兩組,每組各三個(gè)平行.第一組的凈化方法是將1.5 mL提取液通過(guò)氧化鋁柱進(jìn)行凈化.第二組是按照國(guó)標(biāo)方法,將氧化鋁柱用5 mL乙腈活化后,加入1.5 mL提取液通過(guò)氧化鋁柱.對(duì)兩組樣品的回收率進(jìn)行對(duì)比.

國(guó)標(biāo)和本研究方法檢測(cè)流程及精確度對(duì)比.對(duì)6個(gè)草魚(yú)樣品添加濃度為1.0 μg/kg的孔雀石綠和隱色孔雀石綠進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn).將6個(gè)樣品分為2組，每組三個(gè)平行.分別采用國(guó)標(biāo)GB/T 19857-2005水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定和本研究方法進(jìn)行回收試驗(yàn).從檢測(cè)流程和精確度兩方面進(jìn)行對(duì)比.

本研究方法實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下.樣品選取市場(chǎng)上常見(jiàn)水產(chǎn)品品種有草魚(yú)、鯽魚(yú)、鱸魚(yú)、黃顙魚(yú)、小龍蝦,參照國(guó)標(biāo)進(jìn)行制備.稱(chēng)取5.00 g樣品于50 mL離心管中,分別放入20 μL 1 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液3 g NaCl、10.0 mL乙腈.高速渦旋振蕩3 min,超聲波儀器中超聲30 min.然后10000 r/min離心3 min.取約1.5 mL上清液放入事先架在進(jìn)樣瓶上的中性氧化鋁柱中.等待凈化液流入到樣品中,上機(jī)檢測(cè).液相及質(zhì)譜條件參照文獻(xiàn)[5].

作為對(duì)比,稱(chēng)取5.00 g樣品于50 mL離心管中,放入20 μL 1 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液,加入11 mL乙腈，超聲波振蕩提取2 min，8000 r/min勻漿提取30 s，4000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，另取一50 mL離心管加入11 mL乙腈，洗滌勻漿刀頭10 s，洗滌液移入前一離心管中，用玻璃棒搗碎離心管中的沉淀，旋渦混勻器上振蕩30 s,超聲波振蕩5 min,4000 r/min離心5 min,上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25.0 mL，搖勻備用.移取5.00 mL樣品溶液加至用5 mL乙腈活化的中性氧化鋁柱，接收流出液，并用4 mL乙腈洗滌中性氧化鋁柱，收集全部流出液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL，殘液用乙腈定容至1.00 mL，超聲波振蕩5 min,加入1.0 mL 5 mmol/L乙酸銨，超聲波振蕩1 min,樣液經(jīng)0.2 μm濾膜過(guò)濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定.

本研究同時(shí)進(jìn)行了其他水產(chǎn)樣品包括蝦以及各種魚(yú)的添加回收試驗(yàn).采用國(guó)標(biāo)法對(duì)市面上的水產(chǎn)品進(jìn)行篩查,篩選出不含孔雀石綠及隱色孔雀石綠的草魚(yú)、鯽魚(yú)、鱸魚(yú)、黃顙魚(yú)、小龍蝦樣品.在這些陰性樣品中添加1.0 μg/kg、2.0 μg/kg和4.0 μg/kg的孔雀石綠及隱色孔雀石綠,每個(gè)樣品每個(gè)濃度三個(gè)平行.再采用優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)這些樣品進(jìn)行回收率和精密度檢測(cè).

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

利用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(α=0.05).

2 結(jié)果

2.1 提取劑乙腈體積的選擇

比較添加不同體積提取劑乙腈的兩組樣品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠的回收率,可以發(fā)現(xiàn),國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)需要氮吹,耗時(shí)較長(zhǎng)且多次轉(zhuǎn)移,造成孔雀石綠提取時(shí)損失較大.表1為不同提取體積的樣品回收率的比較結(jié)果.結(jié)果顯示,本方法不需要氮吹,且提取凈化時(shí)間較短,孔雀石綠及其代謝物的回收率都能得到滿(mǎn)意的結(jié)果.雖然國(guó)標(biāo)的提取方法也能得到良好的回收率和重復(fù)性,但是考慮到能節(jié)省溶劑,減少提取時(shí)間,本方法具有更好的適用性.

表1 乙腈不同添加體積的樣品回收率

2.2 是否添加NaCl

通過(guò)比較添加NaCl和不添加NaCl兩組樣品的回收率發(fā)現(xiàn),孔雀石綠的回收率沒(méi)有顯著差異(P>0.05).但是,不添加NaCl組中隱色孔雀石綠平均回收率只有10%,與添加NaCl組的回收率值達(dá)到顯著差異(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 添加NaCl和不添加NaCl對(duì)照組的樣品回收率

2.3 凈化方法的選擇

以國(guó)標(biāo)凈化方法進(jìn)行比對(duì),本實(shí)驗(yàn)采用中性氧化鋁柱直接進(jìn)行凈化.檢測(cè)兩組采用不同凈化方法的樣品中的孔雀石綠及其代謝物濃度,對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩組樣品的回收率平均值沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 不同凈化方法對(duì)照組的樣品回收率

2.4 國(guó)標(biāo)法和本研究方法的對(duì)比

分別采用文獻(xiàn)[5]中方法和本研究方法進(jìn)行回收試驗(yàn).從精確度和檢測(cè)流程兩方面進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 兩種檢測(cè)方法精確度及檢測(cè)流程的比較

2.5 回收率和精密度

原標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19857-2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定》中,采用液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定法時(shí)孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠的方法檢出限均為0.5 μg/kg.采用本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)不同樣品進(jìn)行回收試驗(yàn),計(jì)算回收率及相對(duì)偏差(反映精密度),結(jié)果如表5.本實(shí)驗(yàn)中孔雀石綠及其代謝物的回收率在72%～105%之間,孔雀石綠回收濃度的相對(duì)偏差小于13,隱色孔雀石綠回收濃度的相對(duì)偏差小于10,滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求.

表5 水產(chǎn)品中孔雀石綠及隱色孔雀石綠回收率和精密度

3 討論

國(guó)標(biāo)方法中提取體積為25 mL,分取5 mL凈化后定容至2 mL,稀釋倍數(shù)為2.本方法提取體積為10 mL,取適量提取液直接過(guò)氧化鋁凈化柱后上機(jī)檢測(cè),稀釋倍數(shù)也為2.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取體積10 mL對(duì)孔雀石綠和隱色孔雀石綠的回收率沒(méi)有顯著影響(P>0.05).由于孔雀石綠和隱色孔雀石綠極易溶于乙腈,考慮到節(jié)省溶劑和氮吹時(shí)間,以及減少多次轉(zhuǎn)移造成回收損失,本方法采用10 mL提取液效率更高,快速篩查時(shí)適用性更好.

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了是否添加NaCl對(duì)回收率的影響,發(fā)現(xiàn)添加NaCl能顯著提高隱色孔雀石綠的回收率(P<0.05).歐陽(yáng)燕玲[6]和朱程云[7]等采用QuEChERS 方法提取隱色孔雀石綠具有較好的回收率,但孔雀石綠的回收率較低,只有68.7%～72.3%.原因是部分孔雀石綠的提取效果不好或者發(fā)生了轉(zhuǎn)化.本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用添加NaCl的方法,不僅能較好地去除一些水溶性雜質(zhì),同時(shí)通過(guò)使水相和有機(jī)相分層后,減少水分子在過(guò)氧化鋁柱時(shí)與氧化鋁發(fā)生水合反應(yīng),對(duì)孔雀石綠和隱色孔雀石綠產(chǎn)生吸附,提高了孔雀石綠和隱色孔雀石綠的提取效果.

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)比較了是否活化氧化鋁柱對(duì)孔雀石綠及其代謝物的回收產(chǎn)生影響,數(shù)據(jù)分析顯示沒(méi)有顯著差異(P>0.05).這可能是因?yàn)檠趸X柱中的氧化鋁不需要活化即可對(duì)脂肪具有較好的吸附性[8],而孔雀石綠及其代謝物因?yàn)樵谝译嬷辛己玫娜芙庑?被乙腈帶出凈化柱,從而不會(huì)影響其回收率.

綜上,相比國(guó)標(biāo),本實(shí)驗(yàn)的有機(jī)溶劑用量減少.同時(shí),因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)沒(méi)有采用氮吹的過(guò)程,使得檢測(cè)時(shí)間大大縮短,也減少了孔雀石綠及其代謝物在多次轉(zhuǎn)移氮吹過(guò)程中的損失.回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,孔雀石綠及其代謝物的回收率在72%～105%之間,孔雀石綠回收濃度的相對(duì)偏差小于13,隱色孔雀石綠回收濃度的相對(duì)偏差小于10.本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同樣品進(jìn)行了實(shí)際檢測(cè),回收率和精密度均能滿(mǎn)足要求.該實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速,滿(mǎn)足高通量篩查的工作要求.