沈載蕓， 曹成全*， 王向積， 劉方慶， 楊香宇

(1. 樂(lè)山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川樂(lè)山614004； 2. 山東省青島市城陽(yáng)區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 山東青島266109)

魚(yú)蛉亞科Chauliodinae隸屬于廣翅目Megaloptera齒齡科Corydalidae，在齒蛉科中，魚(yú)蛉亞科較齒蛉亞科Corydalinae的屬級(jí)分化更明顯(劉星月，2008)，該亞科世界己知15屬130余種，世界性分布，呈現(xiàn)明顯的間斷分布格局(劉星月，2008；楊定，劉星月，2010)。斑魚(yú)蛉屬Neochauliodes是魚(yú)蛉亞科中最大的屬，世界已知38種及2亞種，分布廣泛，從遠(yuǎn)東一直延伸到東南亞(劉星月，2008；王付彬，2010；楊定，劉星月，2010)，其中，《中國(guó)動(dòng)物志昆蟲(chóng)綱(第五十一卷廣翅目)》(楊定，劉星月，2010)中的東方斑魚(yú)蛉Neochauliodesorientalis和越南斑魚(yú)蛉Neochauliodestonkinensis為同物異名。

在中國(guó)乃至世界的廣翅目昆蟲(chóng)分類研究中，成蟲(chóng)的分類學(xué)研究較為完善(劉星月，2008；楊定，劉星月，2010)，但其余蟲(chóng)態(tài)的分類研究卻很薄弱。世界上多個(gè)現(xiàn)存廣翅目幼蟲(chóng)形態(tài)特征已被描述，包括：馬達(dá)魚(yú)蛉屬M(fèi)adachauliodes(Paulian，1951)、魚(yú)蛉屬Chauliodes和黑魚(yú)蛉屬Nigronia(Cuyler，1958，1965)、帝魚(yú)蛉屬Dysmicohermes、新魚(yú)蛉屬Neohermes和山魚(yú)蛉屬Orohermes(Evans，1972)、原泥蛉屬Protosialis(Flint，1973)、麗魚(yú)蛉屬Chloronia(Penny & Flint，1982)、寬頭齒蛉屬Platyneuromus(Contreras-Ramos & Harris，1998)、異魚(yú)蛉屬Apochauliodes、始魚(yú)蛉屬Archichauliodes、原魚(yú)蛉屬Protochauliodes、澳泥蛉屬Austrosialis和細(xì)泥蛉屬Stenosialis(Theischinger，2000)、星齒蛉屬Protohermes、斑魚(yú)蛉屬、準(zhǔn)魚(yú)蛉屬Parachauliodes、日泥蛉屬Nipponosialis和泥蛉屬Sialis(Hayashi，2005)、新齒蛉屬Corydalus(Azevêdo & Hamada，2006，2007)、寬魚(yú)蛉屬Platychauliodes和梯魚(yú)蛉屬Taeniochauliodes(Liuetal.，2011，2013)、纖泥蛉屬Leptosialis(Priceetal.，2012)、巨齒蛉屬Acanthacorydalis(Cao & Liu，2013)和齒蛉屬Neoneuromus(Caoetal.，2016，2018)等，斑魚(yú)蛉屬的小碎斑魚(yú)蛉N.sparsus(王付彬，2011)和臺(tái)灣斑魚(yú)蛉N.formosanus(Sang & Yeon，2015)的形態(tài)也被描述過(guò)。

僅有少數(shù)屬的蛹形態(tài)特征被描述過(guò)：星齒蛉屬和斑魚(yú)蛉屬(王付彬，2011)、巨齒蛉屬和齒蛉屬(Cao & Liu，2013; Caoetal.，2016，2018)。

本文利用分子數(shù)據(jù)和成蟲(chóng)形態(tài)特征雙重證據(jù)對(duì)雙齒斑魚(yú)蛉Neochauliodesbicuspidatus和越南斑魚(yú)蛉的末齡幼蟲(chóng)和蛹進(jìn)行了分類鑒定，并對(duì)其形態(tài)特征進(jìn)行了詳細(xì)描述。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)采集及處理

試驗(yàn)所用末齡幼蟲(chóng)于2019年3月和2020年3月采自四川省涼山彝族自治州會(huì)理縣南閣鄉(xiāng)涼橋村(102°17′42″E，26°36′58″N，海拔1 900 m)，2種斑魚(yú)蛉生活在一起而常被同時(shí)采集到，均采集于山林一條流速緩慢的小河溝中，常居于石頭下，在無(wú)石頭區(qū)域的厚積腐葉下也采集到少量。

每個(gè)種類采集50～100只，將采集回的活蟲(chóng)按照相關(guān)技術(shù)進(jìn)行養(yǎng)殖(曹成全等，2018a，2018b)，將試蟲(chóng)養(yǎng)至蛹和成蟲(chóng)。

1.2 幼蟲(chóng)和蛹的形態(tài)學(xué)研究

將處理干凈的鮮活完整幼蟲(chóng)和蛹置于有蓋的培養(yǎng)皿中，0 ℃保存1 d以上冷凍休眠，取出置于空氣中0.5 h左右，使其肢體自然伸展，調(diào)整標(biāo)本姿勢(shì)，在LY-WN-YH全自由度超景深系統(tǒng)(成都勵(lì)揚(yáng)精密機(jī)電有限公司)下拍攝,并用校準(zhǔn)的卡尺測(cè)量數(shù)據(jù)，體長(zhǎng)從唇基到腹部末端測(cè)量，頭部長(zhǎng)度從唇基到頭后測(cè)量(0.01 cm)。將拍攝好的試蟲(chóng)進(jìn)行標(biāo)注，并用Photoshop CS6處理。

1.3 試蟲(chóng)物種鑒定

1.3.1 成蟲(chóng)形態(tài)學(xué)鑒定將試蟲(chóng)養(yǎng)殖至成蟲(chóng)后，按照楊定和劉星月(2010)中的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3.2 幼蟲(chóng)和蛹的分子鑒定DNA提?。杭羧颖拘馗共考∪?，取完后用消毒后的小剪刀剪碎，再采用基因組DNA試劑盒(北京天根生物科技)提取總的基因組DNA。

PCR擴(kuò)增以及測(cè)序：COⅠ序列通用引物為C1-J-2183(5’-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3’)和TL2-N-3014 (5’-TCCATTGCACTAATCTGCCAT-ATTA-3’)(張杰，2017)。PCR反應(yīng)體系為 25 μL，包括2×ES TaqMasterMix(cye) 12.5 μL，引物各1.0 μL(0.4 μmol)，ddH2O 8.5 μL，樣品2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 1 min；94 ℃ 0.1 min，55 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1 min，20個(gè)循環(huán)；94 ℃ 0.5 min，45 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1 min，20個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ ∞，1個(gè)循環(huán)。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，PCR產(chǎn)物送生工生物技術(shù)(上海)公司成都生工測(cè)序部進(jìn)行純化和雙向測(cè)序。

數(shù)據(jù)處理：測(cè)序后先在GenBank上對(duì)比，然后再上傳獲得GenBank登錄號(hào)；同時(shí)，將所得序列與其他物種建立系統(tǒng)聚類樹(shù)以比較遺傳距離：外類群和其他內(nèi)類群的DNA序列下載自GenBank，包括櫛角魚(yú)蛉Chauliodespectinicornis(KR148304.1)、污翅斑魚(yú)蛉N.fraternus(KF785799.1)、緣點(diǎn)斑魚(yú)蛉N.bowringi(JQ351950.1)、圓端斑魚(yú)蛉N.rotundatus(KF771894.1)、散斑魚(yú)蛉N.punctatolosus(JX110703.1)和碎斑魚(yú)蛉N.parasparsus(AQU14296.1)，利用DNAman程序打開(kāi)序列，與峰圖軟件(Chromas)對(duì)齊以及與BioEdit進(jìn)行序列比對(duì)，檢查變異序列并剪掉不必要的序列，然后保存為.pir文件，再將此文件導(dǎo)入DanSP 5.0中，生成.nex單倍型文件。再使用Primer，與從GenBank上獲得的COⅠ序列重新命名，在PAUP 4.10中運(yùn)行NJ 樹(shù)，設(shè)置重復(fù)1 000代，得到的樹(shù)文件(.tre)通過(guò)FigTree 1.4.4進(jìn)行可視化和樹(shù)的美化，同時(shí)利用bootstrap(1 000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率，物種兩兩之間的遺傳距離通過(guò)MEGA 6.0(Tamuraetal.，2013)中的P-distance遺傳距離方法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 試蟲(chóng)物種鑒定

試蟲(chóng)養(yǎng)殖至成蟲(chóng)后，通過(guò)形態(tài)鑒定，確定為雙齒斑魚(yú)蛉和越南斑魚(yú)蛉。2種試蟲(chóng)的幼蟲(chóng)和蛹的COⅠ序列GenBank登錄號(hào)分別為：MW560981和MW560982。

7種斑魚(yú)蛉的COⅠ種間遺傳差異為0.089～0.210(表1)，雙齒斑魚(yú)蛉和越南斑魚(yú)蛉與斑魚(yú)蛉屬其他物種的種間遺傳距離范圍分別為0.111～0.190和0.099～0.176。在NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，雙齒斑魚(yú)蛉和越南斑魚(yú)蛉分別形成了單獨(dú)的分支(圖1)，支持率為63.1%，與碎斑魚(yú)蛉聚在一起形成姐妹群，支持率為55.2%，污翅斑魚(yú)蛉和圓端斑魚(yú)蛉聚集在一起，支持率為99.9%。

表1 基于COⅠ序列數(shù)據(jù)的斑魚(yú)蛉屬部分物種之間的遺傳距離Table 1 Genetic distance between some species of the genus Neochauliodes based on COⅠ sequence data

2.2 幼蟲(chóng)形態(tài)描述

2.2.1 雙齒斑魚(yú)蛉末齡幼蟲(chóng)體長(zhǎng)5.10 cm±0.01 cm，體寬0.75 cm±0.05 cm(n=10)(表2)，身體較為粗壯，頭和前胸背板為黑色或黑棕色且基本無(wú)花紋，通體呈棕色或棕褐色(圖2：A、B)。

表2 雙齒斑魚(yú)蛉和越南斑魚(yú)蛉末齡幼蟲(chóng)形態(tài)測(cè)量Table 2 Morphometric information of the final-instar larvae of Neochauliodes bicuspidatus and N. tonkinensis

頭部：長(zhǎng)0.55 cm±0.05 cm，寬0.55 cm±0.15 cm。上唇圓形，淡黃色，中部具有2個(gè)暗褐色斑紋和幾根剛毛。上顎黑色且光滑，骨化明顯。外顎葉黃白相間且上面被毛，下顎棕色。觸角長(zhǎng)0.21 cm±0.01 cm，4節(jié)，棕色，第2節(jié)最長(zhǎng)，第2節(jié)約是第4節(jié)的1.80倍，觸角的近似比例為4∶9∶3∶5。頭部腹面無(wú)明顯的花紋，多凹點(diǎn)(圖2：C)。

胸部：前胸寬0.70 cm±0.01 cm，長(zhǎng)0.60 cm±0.01 cm，中后胸長(zhǎng)寬基本一致。前胸背板黑色或黑棕色，光滑，兩側(cè)具細(xì)長(zhǎng)剛毛，前胸背板腹面前緣有4道黃色豎線，中上部有1個(gè)半月牙形紅棕色骨化片；中后胸背板具有較復(fù)雜且左右對(duì)稱的黑色花紋。足棕色，每個(gè)足末端各有2個(gè)小爪子，足兩側(cè)密被剛毛，每只足腹面的前側(cè)毛少于后側(cè)毛且長(zhǎng)毛和短毛間隔排列(圖2：D、E、F)。

腹部：長(zhǎng)3.12 cm±0.10 cm，10節(jié)，腹節(jié)寬度呈遞減趨勢(shì)，與相應(yīng)呼吸鰓比例近似為 1.14∶1.15∶1.15∶0.94∶0.88∶0.97∶0.69∶0.56(表3)。蟲(chóng)體表面密被短鈍剛毛，每一腹節(jié)有明顯的居中橫狀無(wú)毛區(qū)；腹面比背面顏色鮮艷，每一腹節(jié)都有“∵”形(圖2：G，圖3：A、B、C)的大黃斑點(diǎn)，因體色、體型的差異，顏色和大小存在細(xì)微不同。斑點(diǎn)中央具1個(gè)短粗黑斑，腹節(jié)中部長(zhǎng)短不一的橫狀無(wú)毛區(qū)與下方斑點(diǎn)組成類似“T”型的區(qū)域，但兩者并未直接相連(圖2：G)。腹節(jié)左右兩側(cè)有對(duì)稱的3、4條短線無(wú)毛區(qū)。第8腹節(jié)后緣有1對(duì)呼吸管，呼吸管長(zhǎng)0.20 mm±0.03 mm，第10腹節(jié)尾端兩側(cè)各有1對(duì)骨化的鉤子(圖2：H)，其基部棕黃色，頂端棕黑色。第6腹節(jié)的寬度和氣管鰓長(zhǎng)度變化明顯。背面棕色，表面斑點(diǎn)可能被覆蓋(圖3：D)，少數(shù)為棕褐色，表面具有細(xì)碎黃色斑點(diǎn)(圖3：E、F)。

表3 雙齒斑魚(yú)蛉和越南斑魚(yú)蛉末齡幼蟲(chóng)腹節(jié)及對(duì)應(yīng)氣管鰓測(cè)量Table 3 Morphometric information of the abdominal sections and tracheal gills of the final-instar larvae of Neochauliodes bicuspidatus and N. tonkinensis

2.2.2 越南斑魚(yú)蛉末齡幼蟲(chóng)越南斑魚(yú)蛉末齡幼蟲(chóng)與雙齒斑魚(yú)蛉末齡幼蟲(chóng)整體較相似(圖4:A、B)，前者除整體體色略淡外，其他不同之處如下：

體長(zhǎng)5.15 cm±0.15 cm，體寬0.59 cm±0.01 cm(n=10)，身體較為纖細(xì)，額部具有明顯“∵”形淡黃色單眼(圖4：C)，前胸背板具有復(fù)雜花紋(圖4：D)，光滑，身體附有密集、大小不等的黃色斑點(diǎn)，腹面斑紋存在變異。

頭部：長(zhǎng)0.48 cm±0.03 cm，寬0.45 cm±0.05 cm，頭部紅棕色或棕黑色，額部有可見(jiàn)的“∵”形淡黃色單眼(圖4：C)。觸角長(zhǎng)0.20 cm±0.01 cm，4節(jié)，棕色，第2節(jié)和第4節(jié)最長(zhǎng)，第2節(jié)約是第4節(jié)的1.50倍，觸角的近似比例為3∶9∶2∶6。

胸部：前胸背板長(zhǎng)0.53 cm±0.03 cm，寬0.45 cm±0.05 cm，紅棕色或棕黑色，具有復(fù)雜花紋(圖4：D)，兩側(cè)具有細(xì)長(zhǎng)纖毛，中后胸長(zhǎng)寬幾乎相等，近方形，具有復(fù)雜對(duì)稱的花紋(圖4：E)，足端的2個(gè)小鉤及跗節(jié)部分上的毛明顯少于雙齒斑魚(yú)蛉(圖4:F、G)。

腹部：長(zhǎng)度3.50 cm±0.01 cm，灰褐色或棕色，腹節(jié)寬度先略增后減少，呼吸鰓明顯修長(zhǎng)，尤其第6～8節(jié)，每個(gè)腹節(jié)與對(duì)應(yīng)呼吸鰓的長(zhǎng)度比例關(guān)系為0.93∶0.89∶0.89∶0.94∶0.79∶0.71∶0.56∶0.34(表3)。背面具有密集、大小不等的黃色斑點(diǎn)(圖4：H)，且每一腹節(jié)前后各有1對(duì)由細(xì)碎小斑點(diǎn)聚集成的較大黃色斑點(diǎn)(圖4：H)和明顯的橫線和斜線(圖4：H)。腹面每節(jié)兩側(cè)有2條彎曲的線條(圖4：I)。腹部第8節(jié)后緣有1對(duì)呼吸管(圖4：J)，呼吸管長(zhǎng)0.18 cm±0.05 cm。

腹部腹面斑紋存在一定的變異，經(jīng)統(tǒng)計(jì)共有2種斑型(n=20)：Ⅰ型約25%，Ⅱ型約60%，約15%的個(gè)體兼具2種斑型。Ⅰ型斑紋a、b兩者近似平行(圖5：A、B)，ⅠA型斑紋的a、b、c部分大小近似相等，比ⅠB型斑紋的相應(yīng)部分略寬且d區(qū)域較窄；Ⅱ型斑紋a、b兩者成分開(kāi)趨勢(shì)(圖5：C、D)，ⅡA型斑紋的c部分比ⅡB型斑紋的寬。

2.3 蛹形態(tài)描述

2.3.1 雙齒斑魚(yú)蛉蛹形態(tài)描述在自然狀態(tài)下，蛹呈“C”形彎曲，體色根據(jù)時(shí)間而變化：剛化蛹1 d時(shí)頭部、觸角、胸背板及2對(duì)翅芽嫩黃色，腹部黑褐色，3～4 d時(shí)體色幾乎變?yōu)楹谏?圖6：A、B、C)，直至快羽化時(shí)體色會(huì)再加深。頭部較短粗，近與前胸等寬，頭頂近三角形，有一些長(zhǎng)的剛毛；觸角絲狀，彎曲到頭部的腹面。復(fù)眼卵球形，突出。唇短于頭部，大顎與末齡幼蟲(chóng)相似，前半部分黑色，后半部分棕紅色，有黑色斑點(diǎn)(圖6：B、D)。前胸長(zhǎng)度稍短于寬度，中胸和后胸較為健壯，有黑色無(wú)規(guī)則的斑點(diǎn)，表面被附有較多細(xì)毛；2對(duì)翅芽健碩；腹部飽滿粗壯，腹面可見(jiàn)類似其末齡幼蟲(chóng)的斑紋，腹部第9節(jié)背腹面具有細(xì)長(zhǎng)密集的毛(圖6：E、F)，生殖器發(fā)育完全。

2.3.2 越南斑魚(yú)蛉蛹形態(tài)描述越南斑魚(yú)蛉蛹與雙齒斑魚(yú)蛉蛹整體較相似，后者除整體體色略深、體色變化較快外，其他不同之處如下：

前額凹陷明顯；復(fù)眼卵球形，棕褐色；大顎棕色，與其末齡幼蟲(chóng)相似；腹部腹面有較清晰的斑紋，且每個(gè)腹節(jié)兩側(cè)的下角處有黑點(diǎn)狀斑紋，背面有明顯、細(xì)碎、大小不一的黃色斑塊(圖7：A、B、E)；生殖器發(fā)育健全，腹面飽滿、光滑無(wú)毛(圖7：F、G、H)。

根據(jù)發(fā)育時(shí)間，蛹期體色從嫩黃色(圖7：C)到金黃色(圖7：A、B)再到黑色(圖7：D)，翅芽變化尤其明顯。

3 結(jié)論

雙齒斑魚(yú)蛉末齡幼蟲(chóng)除了體色上略有差異，總體特征相對(duì)穩(wěn)定，而越南斑魚(yú)蛉末齡幼蟲(chóng)種內(nèi)形態(tài)特征差異較大。兩者之間較為穩(wěn)定的形態(tài)特征差異見(jiàn)表4。

表4 2種斑魚(yú)蛉末齡幼蟲(chóng)形態(tài)差異Table 4 Morphological difference of the larvae of two species of Neochauliodes

2種蛹的形態(tài)特征總體上差異不大，具體差異為：前者蛹體色較深，隨時(shí)間體色變化大，后者即便是羽化前1～2 d也只是2對(duì)翅芽顏色加深近黑色，頭、觸角及胸背板部分變棕黑色；前者的腹部第9節(jié)背腹面有密集纖長(zhǎng)的剛毛，而后者相同部位光滑，幾乎無(wú)毛。

形態(tài)上的差異性狀對(duì)于2種斑魚(yú)蛉幼蟲(chóng)和蛹的鑒別具有一定的參考價(jià)值，但幼蟲(chóng)的花紋和體色變異較大，不易作為穩(wěn)定的鑒別特征，且蛹的體色會(huì)隨時(shí)間而不斷改變。

4 討論

本研究形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，雙齒斑魚(yú)蛉和越南斑魚(yú)蛉與其他物種存在明顯的差異；系統(tǒng)發(fā)育分析也表明，雙齒斑魚(yú)蛉和越南斑魚(yú)蛉在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中分別形成了2個(gè)單獨(dú)的分支，因此認(rèn)為兩者很可能為2個(gè)獨(dú)立的物種；然而，由于樣本獲取難度大，雙齒斑魚(yú)蛉和越南斑魚(yú)蛉樣本較少，本研究中分子生物學(xué)數(shù)據(jù)較為單薄，不排除后期研究中在獲取更多樣本后，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果與形態(tài)學(xué)結(jié)果不一致的情況，即雙齒斑魚(yú)蛉種群和越南斑魚(yú)蛉種群聚在一起，形成一個(gè)大的分支，表明兩者形態(tài)學(xué)的差異是由于個(gè)體變異導(dǎo)致。例如，雙齒斑魚(yú)蛉末齡幼蟲(chóng)的足和一些呼吸鰓末端具有黑色斑點(diǎn)，是因受傷導(dǎo)致，或者受環(huán)境尤其是水質(zhì)的影響。因此，在后期研究中將進(jìn)一步補(bǔ)充更多的樣本，對(duì)現(xiàn)有結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以明確雙齒斑魚(yú)蛉和越南斑魚(yú)蛉的分類和系統(tǒng)發(fā)育地位。

致謝：感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)劉星月教授協(xié)助鑒定物種并對(duì)論文撰寫(xiě)提出寶貴意見(jiàn)，感謝沈華瑞、何緒康、沈載富等在標(biāo)本采集和養(yǎng)殖過(guò)程中的協(xié)助和支持。