王麗芳 張德健 張婷婷

（內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/牧草與特色作物生物技術(shù)教育部重點實驗室，010070，內(nèi)蒙古呼和浩特）

土壤微生物的生長代謝活動都發(fā)生在土壤環(huán)境中，其群落的豐富度、均勻度以及優(yōu)勢度與土壤的理化性質(zhì)息息相關(guān)。自然因素與人為因素通過影響土壤的理化性質(zhì)進而影響微生物群落多樣性[1-3]，相比于自然因素，合理的耕作方式、施肥和噴灑農(nóng)藥等田間管理措施改善土壤環(huán)境更易于操作。因為耕作方式對土壤的容重、孔隙度、含水量、溫度、養(yǎng)分含量和pH值等變化有著復(fù)雜的影響[4-7]，直接或間接地影響到土壤微生物的生活環(huán)境，是近些年國內(nèi)外學(xué)者重點研究的方向。

研究表明，土壤環(huán)境、土壤微生物及農(nóng)作物會形成一個相互制約、相互促進的系統(tǒng)，合適的耕作方式可以對這個系統(tǒng)進行優(yōu)化，實現(xiàn)更高的作物產(chǎn)量以及土地利用的可持續(xù)發(fā)展[8]。土壤微生物的存在可以通過自身的代謝活動反作用于土壤環(huán)境，除直接影響農(nóng)作物對營養(yǎng)成分的吸收外，還會影響土壤酶的活性，提高土壤有機質(zhì)含量，釋放一些對農(nóng)作物生長起促進作用的植物激素[9-11]，且研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物群落的改變會影響土壤環(huán)境中植物激素的種類和濃度，從而調(diào)節(jié)農(nóng)作物的生長發(fā)育[12]。同時，人為干預(yù)土壤中微生物的群落種類與數(shù)量對于農(nóng)作物的增產(chǎn)也有十分積極的作用[13]。研究表明，大部分土壤微生物對耕作措施很敏感，并表現(xiàn)出不同的反應(yīng)[14-15]。李景等[16]研究發(fā)現(xiàn)，采用免耕和深松結(jié)合小麥秸稈覆蓋以及小麥-花生輪作等措施均可改善土壤團聚體狀況，提高土壤微生物多樣性指數(shù)。Carpenter-Boggs等[17]研究表明，在免耕系統(tǒng)中，土壤微生物的活性和數(shù)量都顯著高于翻耕土壤。鐘文輝等[18]研究表明，減少土壤耕作結(jié)合秸稈覆蓋可提高表層土壤細菌總量，增加土壤微生物的多樣性。Meriles等[19]發(fā)現(xiàn)在花生-玉米-大豆的輪作體系中，玉米殘茬中木霉菌群顯著增加。Drijber等[20]也發(fā)現(xiàn)在長期小麥輪作種植制度下，土壤細菌群落會發(fā)生變化。但是，在燕麥生產(chǎn)系統(tǒng)下，不同耕作措施對土壤微生物群落多樣性的影響研究還鮮見報道。本研究以燕麥田土壤微生物為研究對象，采用16S rRNA測序技術(shù)及ITS測序技術(shù)探究耕作方式對其群落多樣性的影響，旨在為燕麥農(nóng)田保育和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)優(yōu)化提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗區(qū)地處內(nèi)蒙古呼和浩特市武川縣（40°47′～41°43′N、110°30′～115°53′E），位于內(nèi)蒙古高原南端，海拔約1600m，屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，全年降雨分布不均勻，多集中在夏季，其余時間比較干旱。全年無霜期95～110d，6級以上大風(fēng)天有39d以上。

1.2 試驗設(shè)計

采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，共設(shè)置機械免耕播種和傳統(tǒng)翻耕（CK）2種耕作方式，3次重復(fù)，共6個小區(qū)，小區(qū)面積為150m2（15m×10m），行距20cm，隨機排列。種肥施磷酸二銨120kg/hm2和尿素30kg/hm2，田間采用常規(guī)管理。于燕麥拔節(jié)期和灌漿期采集土壤樣品，4個處理分別為翻耕拔節(jié)期（FGB），免耕拔節(jié)期（MGB），翻耕灌漿期（YGF）和免耕灌漿期（YGM）。在各小區(qū)用“S”形取樣法確定5～7個取樣點，用土鉆鉆取0～20cm的土層，每次取樣500g，將土樣混合均勻，揀出草根和石塊等雜物，放入-80℃冰箱冷藏備用。

1.3 測定項目和方法

將各處理土樣注好標(biāo)簽，制成模板工作液。用MiSeq宏基因組測序法測定細菌群落多樣性，對細菌的16S V4區(qū)進行擴增，稀釋定量至4～5pM后上機進行測序。用454宏基因組測序法檢測真菌群落多樣性，對真菌的ITS區(qū)進行PCR擴增，利用Roche 454 GS FLX+測序儀完成測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測序平臺為Illumina MiSeq平臺[21]。通過RDP-classifier方法，以RDP數(shù)據(jù)庫的序列為基礎(chǔ)，對OTU代表序列進行注釋，在此基礎(chǔ)上使用mothur軟件生成各OTU之間的維恩圖。然后利用樣本之間的物種演化信息和豐度信息進行單線性分析，得到樣本之間差異的距離矩陣。應(yīng)用R（vegan）軟件繪制PCA圖和heatmap圖，再利用軟件MetaPhlAn繪制生物群落結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)質(zhì)序列統(tǒng)計

優(yōu)質(zhì)序列是指有效測序序列中含有特異性擴增引物、不含模糊堿基和長度大于可供分析標(biāo)準(zhǔn)的序列。各處理土壤樣品真菌序列統(tǒng)計結(jié)果見表1，共得到優(yōu)質(zhì)序列66 832條，其中燕麥MGB處理的優(yōu)質(zhì)序列比例最高，占比86.87%，其余3個處理優(yōu)質(zhì)序列比例普遍偏低，且處理間相差不大。

表1 土壤真菌序列數(shù)Table 1 Soil fungal sequences number

不同耕作方式所得土壤樣品細菌序列統(tǒng)計結(jié)果見表2，共得到優(yōu)質(zhì)序列258 304條，YGM的優(yōu)質(zhì)序列比例略高于YGF。

表2 燕麥灌漿期土壤樣品細菌序列數(shù)Table 2 Number of bacterial sequences in soil samples during oat grouting period

2.2 操作分類單元（OTU）聚類分析

OTU（operational taxonomic units）是通過一定的距離測量方法，計算出2個不同序列之間的距離或相似度，然后設(shè)置特定的分類閾值，得到相同閾值下的距離矩陣，并進行聚類運算以形成不同的分類單元。這種對序列進行聚類的方法不需要對每一條序列都進行物種注釋，提高了測序分析的準(zhǔn)確性[22]。

圖1（左）為燕麥田土壤真菌OTU聚類所得到的韋恩圖，可以看出，不同處理共得到真菌種類6096種，其中3810種為4個處理共同具有，占總數(shù)的62.50%。YGF處理特有的真菌種類最多，為33種；而FGB處理特有的真菌種類最少，只有4種。4個處理的真菌種類豐富度由高到低分別為YGM處理（5547種）、MGB處理（5484種）、YGF處理（5413種）、FGB處理（4962種）。

圖1（右）為燕麥田土壤細菌OTU聚類所得到的韋恩圖，共檢測到細菌1578種，其中94種為4個處理共有，約占總數(shù)的6.00%。MGB處理擁有最多的特有性細菌，為454種，其他3個處理中檢測到的細菌種類相差不大。同樣，MGB處理所得細菌種類也最多，并遠高于其他3個處理，為705種。其他3個處理細菌豐富度由高到低為FGB處理（527種）、YGM處理（519種）和YGB處理（451種）。

圖1 不同耕作方式下燕麥田土壤真菌（左）和細菌（右）OTU聚類圖Fig.1 OTU clustering diagram of soil fungi(left)and bacterium(right)in oat field under different tillage methods

2.3 物種豐度分析

豐度分布曲線（rank abundance curve）是分析物種多樣性的一種方式，其構(gòu)造方法是對單個樣本中每個OTU中包含的序列數(shù)進行計數(shù)，根據(jù)豐度（包含的序列數(shù)）從大到小對OTU進行排序，以O(shè)TU等級為橫坐標(biāo)，以每個OTU中所含的序列數(shù)為縱坐標(biāo)繪制成圖。豐度分布曲線可以用來反映微生物的物種豐度和物種均勻度[23]。曲線在橫坐標(biāo)上的范圍反映物種的豐度，范圍越大，物種的豐度越高；曲線的平滑程度反映物種的均勻度，曲線越平緩，物種分布越均勻。圖2為不同耕作方式下燕麥田土壤真菌和細菌豐度分布曲線，很顯然，MGB處理真菌種類的組成最為豐富，物種組成的均勻程度也最高，其他3個處理差異不太明顯；4個處理的細菌種類豐富度與均勻度無較大差異。

圖2 不同耕作方式下燕麥田土壤真菌和細菌豐度分布曲線Fig.2 Distribution curve of soil fungi and bacteria abundance in oat fields under different tillage methods

2.4 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)反映群落內(nèi)物種數(shù)量及其相對豐度，是群落內(nèi)各物種利用同一生境互相競爭或共生的結(jié)果。Alpha多樣性指數(shù)分為3類，物種豐富度指數(shù)、物種均勻度指數(shù)和物種多樣性指數(shù)。物種多樣性指數(shù)是物種豐富度指數(shù)和物種均勻度指數(shù)的綜合。表3中除simpson指數(shù)之外，均與物種豐富度和多樣性都呈正相關(guān)，simpson指數(shù)與物種多樣性呈負(fù)相關(guān)[24-25]。不同耕作方式和不同生育期燕麥土壤微生物多樣性指數(shù)計算結(jié)果見表3，F(xiàn)GB處理的真菌群落豐富度最高（ace=1343.8190，chao=1022.2000），而細菌群落豐富度沒有明顯差異。MGB處理的真菌群落多樣性（shannon=4.6401，simpson=0.0254）和細菌群落多樣性（shannon=6.9325，simpson=0.0030）最高。YGM處理真菌群落多樣性（shannon=3.4812，simpson=0.1053）最低，同時各處理之間細菌群落多樣性指數(shù)差別不大。

表3 不同耕作方式下燕麥不同生育期土壤微生物多樣性指數(shù)Table 3 Soil microbial diversity indexes of oat under different tillage methods and different growth stages

2.5 群落結(jié)構(gòu)分析

利用Qiime對OTU表生成門水平上的物種豐度表和多樣性物種分布圖（圖3和表4）。在土壤真菌群落分布圖中，占優(yōu)勢的門主要有子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）。在門水平上土壤真菌的演替規(guī)律比較明顯，其中子囊菌門在各個處理各生育時期均占絕對優(yōu)勢（64.30%），其中以FGB處理的物種豐度和物種組成最為豐富。相較而言，土壤細菌在各處理以及各時期的物種豐度和物種組成較為均勻。在門水平上比較占優(yōu)勢的是放線菌門（37.30%）、變形菌門（23.50%）和酸桿菌門（12.30%）。

表4 不同耕作方式對燕麥土壤真菌和細菌豐度的影響Table 4 Effects of different tillage methods on the fungi and bacteria abundance of oat soil %

圖3 不同耕作方式對燕麥土壤真菌和細菌分布的影響Fig.3 Effects of different tillage methods on the distribution of oat soil fungi and bacterium

2.6 主成分分析

通過主成分分析（principal components analysis，PCA）可以觀察微生物群落間的差異，2點之間的距離越小，表明2個樣品的微生物群落差別越小[26-27]。圖4是使用R軟件繪制的PCA散點圖，表現(xiàn)出土壤微生物在屬水平上的分類和物種豐富度。由圖4可以觀察到，F(xiàn)GB與MGB處理的真菌群落結(jié)構(gòu)比較接近，而其他處理之間的真菌群落結(jié)構(gòu)差異性明顯。細菌的主成分分析圖則表明，MGB與YGF處理的細菌群落多樣性相似度較高，而其他處理之間的差異度較高。

圖4 真菌和細菌主成分分析Fig.4 PCA of fungi and bacterium

2.7 物種差異分析

將不同的樣品在一定分類水平上，按照物種豐度高低進行聚類，聚類結(jié)果用色塊表示。色塊間的顏色差異可以用來反映多個樣品在群落構(gòu)成上的相似性和差異性[28]。圖5中的每個色塊代表一個樣品的一個屬的豐度，通過不同處理的聚類分析熱圖可以看出，不同的樣品在不同處理方式下均表現(xiàn)出一定程度的相似性，但不同處理對真菌種類的差異性影響表現(xiàn)不同，其中MGB處理的土壤樣品中真菌的種類相對于其他時期的土壤樣品表現(xiàn)出高度的差異性。而不同土壤樣品中細菌種類只有在YGF處理表現(xiàn)出了明顯的相似性，其他時期無明顯相似性或具有一定差異性。相比之下，YGM和MGB處理土壤樣品中細菌的差異性更加明顯。

圖5 不同處理真菌和細菌聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of fungi and bacterium under different treatments

2.8 進化關(guān)系分析

圖6為生物群落結(jié)構(gòu)圖，可以反映樣品中的微生物種類和豐度分布情況，可以觀察到豐度較高的微生物種類。由內(nèi)而外的節(jié)點顯示出群落結(jié)構(gòu)的從屬關(guān)系，依次代表界、門、綱、目、科、屬、種。節(jié)點的大小反映了對應(yīng)分類水平上的物種豐度，豐度≥1%的物種水平在圖中用不同的顏色標(biāo)識出來。線條的長短距離表示進化距離，可以反映物種之間的差異程度[29-30]。燕麥田真菌共檢測到4個目（肉座菌目、柔膜菌目、刺盾炱目和爪甲團囊菌目）和4個科（叢赤殼科、粉褶菌科、黑線菌科和沙漠殼菌科），其中叢赤殼科從屬于肉座菌目，這一支也在整個群落中占據(jù)優(yōu)勢地位，即圖6中的紅色節(jié)點。另外，黑線菌科從屬于刺盾炱目，柔膜菌目、黑線菌科和刺盾炱目在進化上距離較近。燕麥田土壤細菌共檢測到10個屬豐度較大，其中有些屬無法培養(yǎng)或確認(rèn)，可以分辨的有5個屬，分別為索溴桿菌屬、芽生球菌屬、節(jié)桿菌屬、諾卡氏菌屬和微枝形桿菌屬。

圖6 不同處理燕麥田土壤真菌（左）和細菌（右）群落結(jié)構(gòu)圖Fig.6 Community structure of fungi(left)and bacterium(right)in oat fields under different treatments

3 討論

3.1 不同耕作方式下土壤微生物群落多樣性比較

通過本試驗可以發(fā)現(xiàn)與燕麥田土壤微生物多樣性密切相關(guān)的因素為耕作方式的轉(zhuǎn)變。在同一生育時期，免耕處理下的樣品經(jīng)過OUT聚類檢測到更多的微生物種類，物種豐度曲線范圍廣且平滑，simpson和shannon指數(shù)也最高。且通過heatmap熱圖可以看出免耕有利于土壤微生物差異化的形成。以上都表明，免耕處理更有利于形成豐富度和均勻度高的土壤微生物群落。肖琴等[31]和盧闖等[32]的研究表明，免耕方式可以保護土壤中的團粒結(jié)構(gòu)，從而保存土壤水分與溫度，增加土壤有機質(zhì)含量，為微生物生長提供充足養(yǎng)分，有利于微生物量的增加，這與本試驗的研究結(jié)果一致，免耕作為一項保護性耕作技術(shù)，可能成為指導(dǎo)燕麥田田間管理措施的切入點，通過調(diào)節(jié)微生物群落的多樣性來提升土壤肥力和改善燕麥田土壤環(huán)境，有望成為將來的研究趨勢。

3.2 燕麥不同生育期土壤微生物群落多樣性比較

燕麥不同生育期對土壤微生物的種類及數(shù)量也有影響，但本試驗中并不能總結(jié)出統(tǒng)一的規(guī)律。在前人的研究中，作物不同生長期對土壤微生物的影響有不同結(jié)論。研究表明[33-34]，在玉米生長期中微生物的群落多樣性會先增加后減少。這可能是由于各處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯的季節(jié)性變化及生境上的變化。與玉米土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成關(guān)聯(lián)最大的因素是溫度，其次是耕作方式和土壤含水量，土壤養(yǎng)分及pH值影響最小。潘孝晨等[35]則認(rèn)為，土壤微生物量隨作物生長呈上升趨勢，原因可能是作物的根系脫落物可為土壤微生物提供養(yǎng)分。樊曉剛[34]的研究則認(rèn)為不同耕作方式下微生物量及其多樣性存在差異，免耕和少耕等保護性耕作為土壤微生物的生長繁殖創(chuàng)造了良好的生境條件，一定程度上增加了土壤表層微生物量及大量的根系分泌物，增加了微生物種群數(shù)量，有利于維持微生物多樣性，這與本研究結(jié)論一致。不同結(jié)論可能與作物及其生長過程中根際營養(yǎng)環(huán)境發(fā)生變化以及作物與微生物進行營養(yǎng)競爭有關(guān)。

3.3 燕麥田土壤優(yōu)勢真菌種類分析

不同作物種類、不同的耕作方式以及其他各方面可能造成土壤環(huán)境變化的因素決定了土壤微生物的種類與數(shù)量。趙麗琨[36]研究了不同耕作方式對玉米地真菌種類及數(shù)量的影響，得出，玉米土壤真菌的優(yōu)勢屬有鐮孢菌屬、腐霉屬、根霉屬、鏈格孢屬、木霉屬、肉座菌屬、綠僵菌屬、青霉屬和曲霉屬等，這些都分屬于子囊菌門、接合菌門和肉座菌目。徐佳等[37]發(fā)現(xiàn)不同作物田中優(yōu)勢真菌屬有青霉（子囊菌門）、曲霉（子囊菌門）、鐮刀菌（子囊菌門）和木霉（肉座菌目）。本研究發(fā)現(xiàn)燕麥田土壤真菌的優(yōu)勢菌門為子囊菌門和擔(dān)子菌門，優(yōu)勢菌目為肉座菌目、柔膜菌目、刺盾炱目和爪甲團囊菌目，與前人研究基本一致。

3.4 燕麥田土壤優(yōu)勢細菌種類分析

在土壤細菌方面，汪婭婷等[38]的研究表明云南地區(qū)玉米根際微生物群落的優(yōu)勢菌門為擬桿菌門、變形菌門和放線菌門。Jin等[39]在陜西楊凌和河北張家口地區(qū)的試驗發(fā)現(xiàn)，谷子根際微生物的優(yōu)勢菌門為放線菌門和變形菌門。Kwak等[40]通過對番茄土壤微生物的研究得出，變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、厚壁菌門為優(yōu)勢菌門。本試驗所得結(jié)論為燕麥在不同生長發(fā)育期細菌優(yōu)勢菌門主要為放線菌門、酸桿菌門和變形菌門，與前人研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

在傳統(tǒng)翻耕和機械免耕2種處理下，對燕麥拔節(jié)期和灌漿期的土壤微生物群落多樣性進行了分析。結(jié)論如下：從OUT聚類分析、物種豐度曲線、Alpha多樣性分析以及heatmap圖中均可以看出與傳統(tǒng)翻耕相比，免耕處理下土壤微生物多樣性更高，群落之間差異性更大。免耕可以減少土體擾動，有助于土壤大團聚體的形成，保存土壤養(yǎng)分，因此，免耕能為微生物的生命活動創(chuàng)造更好的微環(huán)境，進而增加土壤微生物多樣性。燕麥田土壤真菌群落的優(yōu)勢門有子囊菌門和擔(dān)子菌門；土壤細菌群落的優(yōu)勢門有放線菌門、變形菌門和酸桿菌門。