吳登艷，杜茂濤，譚燃景

重慶醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院，重慶 400010

慢性蕁麻疹(Chronic urticaria，CU)是以反復發(fā)生的風團、瘙癢為主要表現(xiàn)的常見疾病，病程常遷延達6周以上．CU的病因復雜且隱匿，因此將大多數(shù)(>80%)無明顯誘因的CU歸為慢性自發(fā)性蕁麻疹(Chronic spontaneous urticaria，CSU)[1]．大量研究表明，CSU患者常同時伴隨幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染，經(jīng)規(guī)范抗Hp治療后，大部分患者的蕁麻疹癥狀可得到緩解或完全消退，這些研究均提示Hp感染和CSU發(fā)病有著非常密切的相關性[2-5]．

肥大細胞的激活是蕁麻疹發(fā)病的關鍵，它常由其胞膜外的FcεRI受體和IgE交聯(lián)觸發(fā)[1]．關于Hp相關體液免疫與CU發(fā)病機制的研究一直熱度不斷，Hizal等[6]發(fā)現(xiàn)血清抗Hp IgG陽性的蕁麻疹患者自體血清皮膚試驗陽性率(40%)顯著高于血清抗Hp IgG陰性的蕁麻疹患者(14.3%)，而自體皮膚血清試驗已被廣泛用于檢測與CSU發(fā)病密切相關的抗肥大細胞FcεRI抗體，Sun等[7]也發(fā)現(xiàn)抗Hp抗體陽性和抗TGAb陽性的CU患者血清抗FcεRI抗體陽性率較對照組顯著增高．但也有一些研究表示Hp感染與致CSU發(fā)病的自身抗體的產生無關[8]．Hp是一種能長期定植于胃腸道粘膜上皮細胞的微需氧革蘭氏陰性桿菌，宿主持續(xù)的帶菌狀態(tài)可產生特異性體液免疫，導致感染局部粘膜和全身抗Hp特異性抗體高表達，包括IgA，IgE和IgG類抗體．鑒于肥大細胞的胞膜外尚有多種正性效應的受體，除了對IgE表現(xiàn)高親和力的FcεRI受體外，循環(huán)免疫復合物受體、低親和力的IgG受體、補體受體等的特異性結合也可促使肥大細胞活化．Acua等[9]對30例CU進行檢測，其中血抗Hp IgG抗體陽性率為60.0%，IgM陽性率為33.3%；Galadari等[10]也發(fā)現(xiàn)血清抗Hp IgG，IgM抗體陽性率在CU患者中顯著增高；Rostamy等[11]對43例CU患者血清特異性抗Hp-IgG，IgA，IgG聯(lián)合IgA進行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性率分別為72.1%，46.5%和44.18%，與40例正常對照(37.5%，40%，27.5%)比較差異具有統(tǒng)計學意義；Liutu等[12]甚至用免疫印跡的方法在Hp中發(fā)現(xiàn)了IgE結合表位，提示Hp誘導的循環(huán)細菌特異性抗體可能在CU發(fā)病中起了重要作用．更早期的研究對比均伴Hp感染的CU及非CU患者，前組可檢出高滴度血清抗Hp-Lpp20蛋白的IgG，IgA抗體，這也是目前為止僅有的一項提出Hp具體蛋白成分特異性抗體參與CU發(fā)病的研究[13]．但到目前為止，Hp介導的體液免疫和CU/CSU發(fā)病的相關研究樣本數(shù)量較少，針對大樣本的CSU血清抗Hp和其Lpp20蛋白抗體水平的研究鮮有報道，迫切需要在CSU大樣本中調研Hp特異性抗體水平，并探討其可能的致病機制．本研究擬納入較大樣本的CSU患者及對照組，檢測各組血清抗Hp和抗Hp-Lpp20的IgE、IgG 和IgA水平，明確抗體分布情況，并探討Hp感染促發(fā)的體液免疫在CSU發(fā)病中的角色及可能的機制．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 血清樣本、菌株、質粒

CSU病例的血清樣本： 2014年7月-2015年1月在重慶大坪醫(yī)院就診并確診為CSU的211例患者，其中112例女性(排除妊娠)，99例男性，年齡為14-69周歲(38.79±4.22歲)．本研究納入的CSU： ① 均符合2018年歐洲變態(tài)反應和臨床免疫學(EAACI)會議的CSU診斷標準[1]；② 病程6周至7年不等，平均1.8年；③ 無用藥史，近一周否認抗組胺治療，近一月否認使用糖皮質激素、免疫抑制劑；④ 否認重大基礎疾病及遺傳、傳染病病史；⑤ 從未接受過規(guī)范的抗Hp治療．健康對照組的血清樣本： 同期大坪醫(yī)院體檢中心常規(guī)體檢結果正常的志愿者，對照組在年齡、性別等一般條件上與CSU組匹配．納入志愿者137例，其中73例女性(排除妊娠)，64例男性，年齡為18-66周歲(38.29±3.37歲)．納入的對照組： ① 無過敏性疾病病史；② 一般檢查無異常(二便、血常規(guī)，肝腎功)；③ 無重大基礎疾病及遺傳、傳染病病史；④ 從未接受過規(guī)范的抗Hp治療．EDTA抗凝管收集各受試者外周靜脈血，2 h內靜置離心、收集血清．菌株和質粒 Hp 26695標準株購自美國菌種保藏中心 (ATCC)；BL21(DE3) 感受態(tài)大腸桿菌購自北京天根公司；由本實驗室制備的pET22b-Lpp20 重組質粒已轉入DH5α感受態(tài)大腸桿菌，氨芐西林(Amp)抗性[14]．

1.1.2 主要試劑

標準Hp-ELISA血清檢測試劑盒購于北京貝爾生物公司；質粒抽提試劑盒購于Omega公司；細菌基因組DNA抽提試劑盒購于北京達科為公司；Chelating Sepharose Fast Flow純化柱購于Pharmacia 公司；生物素-山羊抗人IgE，IgA購自英國AbD serotec公司；HRP-羊抗人IgG購自北京中杉公司；HRP-鏈霉親和素購自美國Abbkine公司；TMB顯色液購于北京天根公司；BCA蛋白濃度試劑盒購于Sigma公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購于上海碧云天公司；N-端測序送中國科學院測定．

1.2 試驗方法

1.2.1 Hp感染陽性率測定

用標準的Hp-ELISA試劑盒就CSU組和對照組Hp感染陽性率(抗CagA及HSP聯(lián)合抗原的IgG抗體)進行檢測．具體操作嚴格遵守說明書，酶標儀450 nm讀取OD值．

1.2.2 血清特異性抗Hp全菌抗原IgG，IgE和IgA抗體檢測

(1) Hp的培養(yǎng)和菌體尿素裂解液的制備

① 細菌培養(yǎng)[14]： 將保種的Hp菌液接種于固體Hp培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)長出的菌落，再次接種入布氏肉湯培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)擴增到對數(shù)分裂期．② Hp尿素裂解液的制備： 菌液用磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)重懸洗滌3次，離心后將菌體沉淀加入尿素溶液(8 M)中，充分吹打后即成，BCA法測蛋白質量濃度．

(2) 抗Hp-IgG，IgE和IgA抗體水平測定

① 間接ELISA法測定抗Hp-IgG： 20 μg/mL的Hp尿素裂解液包被酶標板，加入1∶40稀釋血清100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板后加入1∶3 000稀釋的HRP-羊抗人IgG 100 μL/孔，孵育1 h，洗板后拍干板中液體，加入顯色液避光顯色15 min，終止反應，450 nm讀取OD值．每樣本設3復孔，同時設無血清對照孔．② 生物素-親和素ELISA法測定抗Hp-IgE/IgA： 將各血清1∶20稀釋后加樣入Hp尿素裂解液包被的酶標板，37 ℃，1 h孵育后洗板，加入1∶10 000的生物素-山羊抗人IgE或 1∶2 000的生物素-山羊抗人IgA孵育1 h，洗板，加入1∶6 000 HRP-鏈霉親和素孵育35 min，加入TMB顯色液顯色20 min，終止反應，450 nm讀取光密度(OD)值．同時設置復孔及無血清對照．

1.2.3 血清特異抗Hp-Lpp20-IgG、IgE和IgA抗體檢測

(1) Lpp20的表達和純化[14]

將pET22b-Lpp20-DH5α菌液培養(yǎng)擴增后提取重組質粒DNA并經(jīng)NdeI+XhoI雙酶切鑒定正確，再將質粒轉入感受態(tài)BL21(DE3)中，構建工程菌pET22b-Lpp20-BL21(DE3)并誘導質粒表達．SDS-PAGE凝膠電泳法鑒定重組Lpp20蛋白的表達，鎳離子親和層析法純化蛋白，蛋白濃度測定(BCA)法測定濃度，并送中國科學院進行N-端測序，增強化學發(fā)光法鑒定Lpp20重組蛋白的抗原反應性．

(2) 抗Lpp20-IgG，IgE，IgA抗體水平測定

取Lpp20以5 μg/mL的質量濃度，將各血清1∶20稀釋加入包被好的酶標版中，檢測各樣本中抗Lpp20-IgG，IgE，IgA抗體水平．同時設置復孔及無血清對照．

1.3 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析并作圖，Hp感染的陽性率(%)行卡方檢驗比較，p小于0.05判定為差異具有統(tǒng)計學意義；正態(tài)計量資料用均數(shù)±標準差(x±s)表示，組間進行非配對t檢驗比較，p小于0.05判定為差異具有統(tǒng)計學意義．

2 結 果

2.1 CSU組和對照組Hp感染陽性率

CSU組和對照組均進行血清抗Hp-ELISA標準試劑盒檢測，結果表明，在CSU組中，抗Hp抗體陽性率為73.46%(155/211)，對照組中陽性率為51.82%(71/137)，兩組行卡方檢驗(χ2=17.08，p=0.000)具有統(tǒng)計學意義(表1)，可認為CSU發(fā)病與Hp感染有密切的相關性．

1. Marker；2-6. 不同條件下的收集管；7. 目的蛋白．圖2 SDS-PAGE凝膠電泳檢測重組Lpp20蛋白的純化

表1 CSU組和對照組的血清抗Hp抗體ELISA標準試劑盒陽性率

1. 誘導前的pET22b-Lpp20-BL21；2. IPTG誘導4 h；3. 空載體pET22b /BL21由IPTG誘導4 h．圖1 SDS-PAGE凝膠電泳檢測重組蛋白Lpp20的表達

2.2 Lpp20重組蛋白的表達、純化和鑒定

將誘導表達的pET22b-Lpp20-BL21用SDS-PAGE凝膠蛋白電泳進行檢測，誘導4 h的工程菌在20 kDa附近有新的蛋白表達條帶，目的蛋白表達成功(圖1)．目的蛋白的純化使用鎳離子親和層析法，將不同設置參數(shù)下的收集液分別用SDS-PAGE電泳進行檢測，其中目的蛋白純度可達90%，經(jīng)分子篩濃縮后BCA法測定蛋白質量濃度為2.2 mg/mL(圖2)．重組蛋白的N端測序為NH2-Met-Lys-Asn-Gln-Val，F(xiàn)asta將此序列與蛋白質數(shù)據(jù)庫進行比較，與預期的Lpp20的N-端蛋白序列一致；重組Lpp20蛋白經(jīng)增強化學發(fā)光法鑒定具有良好的抗原反應性(圖略)．

2.3 CSU組及對照組的血清抗Hp全菌抗原和抗Lpp20的 IgE，IgG及IgA水平

通過2.1的結果，將CSU組分為： ①CSU(+)Hp(+)組，計155例，②CSU(+)Hp(-)組，計56例；將對照組分為： ③CSU(-)Hp(+)組，計71例，④CSU(-)Hp(-)組，計66例．經(jīng)生物素-親和素ELISA法測定顯示，抗Hp-及抗Lpp20-IgE分別在①，②組間(0.082±0.002 vs 0.074±0.003，p1=0.076；0.085±0.003 vs 0.083±0.003，p2=0.622)；①，③組間(0.082±0.002 vs 0.078±0.003，p1=0.382；0.085±0.003 vs 0.082±0.005，p2=0.597)比較，差異不具有統(tǒng)計學意義(圖3a、圖3d)．

a. ①CSU(+)Hp(+)組抗Hp全菌-IgE(0.082±0.002)，vs②CSU(+)Hp(-)組(0.074±0.003)、vs③CSU(-)Hp(+)組(0.078±0.003)，t1=1.785，P1=0.076，t2=0.877，P2=0.382．b. ①組抗Hp全菌-IgG(1.053±0.022)，vs②組(0.890±0.028)、vs③組(1.222±0.034)，t1=4.256，P1=0.000，t2=4.312，P2=0.000，③組vs④CSU(-)Hp(-)組(0.816±0.020)，t3=10.20，P3=0.000．c. ①組抗Hp全菌-IgA(0.660±0.022)，vs②組(0.559±0.030)、vs③組(0.849±0.037)，t1=2.600，P1=0.01，t2=2.381，P2=0.019；③組vs④組(0.730±0.032)，t3=4.63，P3=0.000．d. ①組抗Lpp20-IgE(0.085±0.003)，vs②組(0.083±0.003)、vs③組(0.082±0.005)，t1=0.494，P1=0.622，t2=0.530，P2=0.597．e. ①組抗Lpp20-IgG(1.459±0.012)，vs②組(1.422±0.019)、vs③組(1.494±0.016)，t1=1.631，P1=0.105，t2=1.720，P2=0.087；③組vs④組(1.449±0.016)，t3=2.017，P3=0.046．f. ①組抗Lpp20-IgA(1.229±0.020)，vs②組(1.124 ±0.033)、vs③組(1.251±0.033)，t1=2.813，P1=0.005，t2=0.602，P2=0.548；③組vs④組(1.098±0.035)，t3=3.171，P3=0.002．H. pylori： 幽門螺桿菌．抗體水平用均數(shù)±標準差(x±s)表示．圖3 CSU組及對照組血清抗Hp全菌-和抗Lpp20-IgE，IgG，IgA水平

經(jīng)間接ELISA法測定顯示，抗Hp-IgG在①，②組間(1.053±0.022 vs 0.890±0.028，p=0.000)，③，④組間(1.222±0.034 vs 0.816±0.020，p=0.000)比較，差異具有統(tǒng)計學意義，表明Hp感染后，人群中血清抗Hp全菌-IgG水平顯著升高；①，③組間(1.053±0.022 vs 1.222±0.034，p=0.000)比較，①組抗體水平明顯低于③組，且差異具有統(tǒng)計學意義(圖3b)．抗Lpp20-IgG在①，②組間(1.459±0.012 vs 1.422±0.019，p=0.10)，①，③組間(1.459±0.012 vs 1.494±0.016，p=0.087)比較，差異不具有統(tǒng)計學意義；但③，④組間(1.494±0.016 vs 1.449±0.016，p=0.046)比較，差異具有統(tǒng)計學意義(圖3e)．經(jīng)生物素-親和素ELISA法測定顯示，抗Hp-IgA在①，②組間(0.660±0.02 vs 0.559±0.030，p=0.01)，③，④組間(0.849±0.037 vs 0.730±0.032，p=0.000)比較，差異具有統(tǒng)計學意義，表明Hp感染后，人群中血清抗Hp全菌-IgA水平顯著升高；①，③組間(0.660±0.02 vs 0.849±0.037，p=0.019)比較，①組水平低于③組，且差異具有統(tǒng)計學意義(圖3c)．抗Lpp20-IgA在①，②組間(1.229±0.020 vs 1.124 ±0.033，p=0.005)，③，④組間(1.251±0.033 vs 1.098±0.035，p=0.002)比較，差異具有統(tǒng)計學意義，表明Hp感染后人群中血清抗Hp-Lpp20-IgA水平顯著升高；但是①，③組間(1.229±0.020 vs 1.251±0.033，p=0548)比較，差異不具有統(tǒng)計學意義(圖3f)．

3 討 論

越來越多的研究揭示了CSU發(fā)病與Hp感染相關[2-5]，在EAACI最新發(fā)布的蕁麻疹診療指南中，已將檢測Hp感染情況納入CSU常規(guī)診療計劃中[1]．本研究首先用標準化Hp-ELISA試劑盒檢測了CSU人群和健康對照中Hp感染陽性率(包括既往感染和現(xiàn)癥感染)，數(shù)據(jù)顯示CSU人群中Hp感染陽性率明顯高于健康對照，證明Hp感染和CSU發(fā)病存在密切的相關性(表1)．蕁麻疹發(fā)生的關鍵病理機制是肥大細胞活化、脫顆粒，繼而合成和釋放炎性介質，而其中最經(jīng)典的肥大細胞激活途徑是IgE與其胞膜外的FcεRI受體病理性結合，Hizal等[6]發(fā)現(xiàn)血清抗Hp IgG陽性的蕁麻疹患者自體血清皮膚試驗陽性率(40%)顯著高于血清抗Hp IgG陰性的蕁麻疹患者(14.3%)，而自體皮膚血清試驗已被廣泛用于檢測與CSU發(fā)病密切相關的抗肥大細胞FcεRI抗體，Sun等[7]也發(fā)現(xiàn)抗Hp抗體陽性和抗TGAb陽性的CU患者血清抗FcεRI抗體陽性率較對照組顯著增高，提示Hp感染可能通過誘導產生外周血抗FcεRI抗體升高的途徑促進蕁麻疹發(fā)生；但也有一些研究表示Hp感染和致CSU發(fā)病的自身抗體的產生無關．同時，肥大細胞表面仍分布有其它正性調節(jié)受體，如循環(huán)免疫復合物受體、IgG受體等，這些受體在特異性體液免疫亢進時和相應的配體結合，也能夠引起細胞活化，促進后繼炎癥反應[1]．感染Hp后的長期帶菌狀態(tài)可使宿主產生持續(xù)性體液免疫，導致感染局部粘膜和循環(huán)抗Hp抗體水平增加，包括IgG，IgA 和IgE等，雖然這些抗體對于清除Hp定植作用甚微，卻可能在其他病理機制中發(fā)揮作用．如已有研究揭示，在伴隨Hp感染的CU病例中，血清抗Hp-IgG，IgA水平顯著高于伴隨Hp感染的非CU對照．Bakos等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)，在伴隨Hp感染的CU受試組中，存在高滴度血清抗Hp-Lpp20-IgG及IgA，這些研究都提示Hp感染介導的體液免疫可能在某些CU發(fā)病中發(fā)揮了重要作用．但既往相關研究納入的樣本量極少，迄今未見關于大樣本CSU中Hp全菌及Lpp20血清特異性抗體的調研分析，因此本研究就CSU患者和健康對照中抗Hp全菌和其Lpp20血清特異性的IgE，IgG和IgA水平進行調研，以期揭示Hp引起的體液免疫在CSU發(fā)病中所扮演的角色．

本研究通過對受試血清樣本細菌特異性IgE進行檢測發(fā)現(xiàn)，在各受試組中(CSU(+)Hp(+)組、CSU(-)Hp(+)組、CSU(+)Hp(-)組、CSU(-)Hp(-)組)，血清特異性抗Hp全菌-和Lpp20-IgE抗體均處于差異不具有統(tǒng)計學意義的低值水平(組間比較p均大于0.05)(圖3a、圖3d)，表明Hp感染不能有效激發(fā)機體的IgE型體液免疫，且所產生的低水平細菌特異性IgE與CSU發(fā)病無相關性．通過檢測受試血清中細菌特異性IgG發(fā)現(xiàn)，不論在CSU組還是對照組，感染Hp后均能引起外周循環(huán)中抗Hp全菌-IgG顯著升高(p<0.05)，但CSU(+)Hp(+)組中抗Hp全菌-IgG水平顯著低于CSU(-)Hp(+)組(p<0.001，圖3b)，揭示在CSU人群中，Hp感染后激發(fā)IgG型體液免疫的強度遠遠小于無CSU人群，我們因此推測雖然感染Hp可誘導宿主產生高水平特異性的IgG抗體，但是這種體液免疫效應并不是促進CSU發(fā)病的重要病理機制．同樣的，不論在CSU組還是對照組中，感染Hp后血清中抗Lpp20-IgG水平均升高，但這種升高趨勢只在CSU(-)Hp(+)組中差異具有統(tǒng)計學意義，并且CSU(+)Hp(+)組血清抗Lpp20-IgG水平也低于CSU(-)Hp(+)組，但兩組間差異不具有統(tǒng)計學意義(圖3e)，因此我們認為Hp感染可以通過其Lpp20蛋白誘導宿主產生較高水平的血清特異性IgG，雖然Lpp20是Hp中具備良好免疫原性的成分蛋白，但它卻不是Hp感染致CSU發(fā)病的重要病因．通過檢測受試血清細菌特異性IgA發(fā)現(xiàn)，不論在CSU組或對照組，感染Hp后都會引起血清抗Hp全菌-和抗Lpp20-IgA顯著升高(p<0.05)，且CSU(+)Hp(+)組中血清特異性抗Hp全菌-IgA水平顯著低于CSU(-)Hp(+)組(p<0.05)，而這兩組間的抗Lpp20-IgA水平差異不具有統(tǒng)計學意義(圖3c、圖3f)．我們推測，雖然感染Hp可激發(fā)宿主產生血清高水平特異性IgA，而Hp-Lpp20又是參與此反應的具備良好免疫原性的成分，但是這種IgA型體液免疫反應并非Hp感染相關性CSU的主要致病機制．至于CSU(+)Hp(+)組中抗Hp全菌-IgG，IgA水平較CSU(-)Hp(+)組更低(p<0.05)，我們推測是由于部分病例Hp感染后更向Th1型免疫反應偏移[15]，表現(xiàn)為血清抗體水平低，而胃腸道粘膜細胞免疫增強使粘膜損傷更嚴重，細菌或其代謝產物可直接接觸胃腸道固有層肥大細胞，進一步使其活化而誘發(fā)包括蕁麻疹在內的炎癥反應；或者也可能是CSU宿主在蕁麻疹炎癥狀態(tài)和Hp感染定植的相互作用下，能夠通過某些機制削弱Hp介導的體液免疫反應．已有研究表明，CU患者血清sIL-2R水平與類胰蛋白酶水平顯著相關，提示CU患者T細胞活化與肥大細胞脫顆粒成正比，CU患者具有更亢進的外周血T細胞活性[16]．

我們有理由推斷，雖然感染Hp可以導致宿主產生高水平的血清特異性IgG，IgA，并且Hp-Lpp20因具備良好的免疫原性；也在Hp感染觸發(fā)的體液免疫中占有重要權重，但在與Hp感染相關的CSU病程中，Hp細菌特異性抗體的產生并不是主要致病機制，也即Hp并不是通過誘發(fā)體液免疫促進CSU發(fā)病．我們認為，機體感染Hp后存在除體液免疫外的其他一些途徑促進肥大細胞活化參與CSU發(fā)病．已經(jīng)有一些研究表明，某些Hp蛋白如VacA和NAP，可通過引起肥大細胞的胞內鈣振蕩或G蛋白介導的MAPK，PI3K/Akt信號通路活化的方式直接激活人肥大細胞[17-18]，提示Hp感染后極有可能通過直接作用的方式活化粘膜固有層肥大細胞，促進CSU發(fā)病．我們的研究成果也更加全面地對Hp這種直接活化肥大細胞的方式做了補充[19]．

本研究揭示了Hp感染和CSU發(fā)病的相關性，首次在大樣本的CSU病例中調研了血清特異性抗Hp全菌-及Lpp20-IgE，IgG，IgA水平，論證了Hp血清特異性抗體并非Hp感染相關性CSU的病因．雖然我們的研究并未完全揭示Hp感染致CSU的發(fā)病機制，但卻給相關研究提供了新的思路，避免了某些研究資源的浪費．