張路 劉佳勇 白楚杰 薛瑞峰 李舒 高天 譚智超 王新宇 方志偉 樊征夫

軟組織肉瘤（soft tissue sarcomas, STS）是一類(lèi)起源于間葉組織的少見(jiàn)腫瘤，包括70 多種不同亞型，每年在世界范圍內(nèi)大約有20 萬(wàn)新發(fā)病例[1]。雖然STS各組織學(xué)亞型的生物學(xué)特性不盡相同，但是既往治療方法卻基本一致：擴(kuò)大切除手術(shù)輔以放療的局部治療以及蒽環(huán)類(lèi)為基礎(chǔ)的化療，是近年來(lái)STS 系統(tǒng)治療的基石。經(jīng)過(guò)治療后仍有高達(dá)40%的STS 患者發(fā)生轉(zhuǎn)移。盡管諸多研究在探索更好的藥物及治療方案，但是已發(fā)生轉(zhuǎn)移的STS 患者中位總生存時(shí)間（median overall survival，mOS）僅略有改善，約為12～18 個(gè)月[2]。

近年來(lái)，STS 的個(gè)體化治療逐步被接受，而分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和靶向藥物的進(jìn)步為STS 的個(gè)性化診斷和治療提供了新的思路。二代基因測(cè)序（nextgeneration sequencing，NGS），又稱(chēng)為高通量測(cè)序技術(shù)，可以分析基因變異、腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）及微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）狀態(tài)等特征，不僅可以提示與化療、靶向和免疫治療的相關(guān)信息，還能根據(jù)患者基因檢測(cè)結(jié)果尋找匹配的美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局（FDA）批準(zhǔn)藥物和臨床試驗(yàn)藥物，從而輔助臨床制定治療方案。

目前大規(guī)模的分子檢測(cè)主要集中在上皮性和血液系統(tǒng)惡性疾病。盡管美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）或中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（CSCO）指南針對(duì)STS均有相關(guān)的分子檢測(cè)推薦[3-4]，但是僅少量肉瘤亞型存在具有治療意義的基因變異，且大部分證據(jù)級(jí)別不足。因此，考慮到STS 基因組的復(fù)雜性和異質(zhì)性，擁有足夠數(shù)量的樣本進(jìn)行研究，對(duì)于明確驅(qū)動(dòng)基因及新療法的研發(fā)至關(guān)重要。在本研究中，報(bào)告了108 例STS 患者的NGS 檢測(cè)數(shù)據(jù)，分析了中國(guó)人群STS 常見(jiàn)的基因變異，為患者的個(gè)體化治療提供了參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2018年1月至2019年12月北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院收治的STS 患者。所有患者的組織標(biāo)本均經(jīng)過(guò)病理科專(zhuān)家的審核并確診為STS，且納入本研究的STS 患者均接受了NGS 檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 分子檢測(cè)方法 應(yīng)用NGS 技術(shù)對(duì)與108 例患者組織樣本進(jìn)行高通量測(cè)序：提取DNA/RNA 后，將原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行單核苷酸變異、移碼突變、插入/缺失、拷貝數(shù)變異、基因融合等所有基因組變異類(lèi)型的生物信息學(xué)分析，同時(shí)對(duì)基因變異類(lèi)型進(jìn)行篩選和注釋?zhuān)治鰴z測(cè)結(jié)果。提供基因檢測(cè)服務(wù)的公司有上海思路迪生物技術(shù)有限公司、北京泛生子基因科技有限公司和廣州燃石醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司。

1.2.2 觀察指標(biāo) 108 例STS 患者組織學(xué)亞型及基因變異概況：包括各組織學(xué)亞型例數(shù)以及基因變異數(shù)≥1 的患者分布情況。

1.2.3 TMB 腫瘤細(xì)胞基因組編碼區(qū)中平均1 Mb（100 萬(wàn)個(gè)堿基）范圍內(nèi)所包含的體細(xì)胞變異數(shù)量（非同義突變、插入/缺失）為基因水平的突變檢測(cè)。根據(jù)TMB 值分為高（≥10 muts/Mb）、中（5～10 muts/Mb）和低（<5 muts/Mb）3 類(lèi)。

1.2.4 MSI 狀態(tài) 指與正常組織相比，在腫瘤中某一微衛(wèi)星由于重復(fù)單位的插入或缺失而造成的微衛(wèi)星長(zhǎng)度的任何改變，出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因現(xiàn)象。MSI狀態(tài)分為3 類(lèi)：微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（MSI-H），低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-L），微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。本次檢測(cè)使用NGS 技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)算法，計(jì)算該樣本在患者樣本中的MSI score，其中MSI score≤0.05 為MSS；0.050.1 為MSI-H。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)存在臨床治療意義的基因變異情況：1）臨床指南建議：符合NCCN[3]或CSCO[4]中STS 指南的治療建議；2）超適應(yīng)證治療：超出藥品說(shuō)明書(shū)所標(biāo)明的適應(yīng)證范圍用藥。藥品的超適應(yīng)證使用通常有2 種類(lèi)型：超出美國(guó)FDA 批準(zhǔn)的適應(yīng)證，或超出批準(zhǔn)的使用人群。將本研究中所有檢出的78 個(gè)基因名稱(chēng)于FDA 官方數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行全瘤種檢索，查詢(xún)其獲批藥物信息，檢索截止日期為2021年3月26日；3）臨床試驗(yàn)招募：指存在正在招募中的針對(duì)特定變異基因的STS臨床試驗(yàn)。利用關(guān)鍵詞“Soft tissue sarcomas”和本實(shí)驗(yàn)所有檢出的78 個(gè)基因名稱(chēng)，對(duì)PubMed、Clinical Trials 及中國(guó)藥物臨床試驗(yàn)等級(jí)與信息共識(shí)平臺(tái)等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了檢索。檢索的時(shí)間范圍為2015～2020年，僅針對(duì)狀態(tài)為“招募中”的臨床研究進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果

2.1 108 例STS 患者組織學(xué)亞型及基因變異概況

本研究共納入108 例STS 患者，常見(jiàn)的組織學(xué)亞型為平滑肌肉瘤19 例，脂肪肉瘤13 例，滑膜肉瘤11 例。比例最高的組織學(xué)亞型為纖維肉瘤85.7%（6/7），脂肪肉瘤84.6%（11/13），和原始神經(jīng)外胚層腫瘤（primitive neuroectodermal tumor，PNET）/Ewing 肉瘤83.3%（5/6），見(jiàn)表1。全組共發(fā)現(xiàn)78 種變異基因，基因變異檢出頻次排名前10 位的基因由高到低分別為T(mén)P53 12.3%（22/179）、MDM2 7.3%（13/179）、CDK4 5.6%（10/179）、CDKNB 3.9%（7/179），RB1 3.9%（7/179），ALK 2.8%（5/179），ATRX 2.8%（5/179），MCL1 2.8%（5/179），F(xiàn)GFR1 2.2%（4/179），PIK3CA 2.2%（4/179），見(jiàn)圖1。

表1 108 例STS 各組織學(xué)亞型基因變異及臨床治療意義概況

2.2 統(tǒng)計(jì)存在治療意義的基因變異情況：

78 種基因變異中，共39 種對(duì)患者存在臨床治療指導(dǎo)意義。其中，有3 種符合臨床指南建議，包括：ALK、CDK4 和CDK6；有23 種符合超適應(yīng)證治療，包括：ALK、ATM、ATRX、BARD1、BRCA、CCND1、CCND2、CCND3 、CDK4 、CDK6 、CDKN2A、EWSR1-ATF1、EWSR1-DDIT3 、EZH2 、FANCA、KIT、MET 、NRAS 、PDGFRA 、PIK3CA 、RET、ROS1 和TSC2；有27 種符合臨床試驗(yàn)招募，包括：ALK、ATM、ATRX、BARD1、BRCA、CDK4、CDK6、EPHA2、EWSR1-ATF1 、FGFR1 、FGFR2 、FGFR3、HRAS、IGF1R、KDR、KIT、MDM2、MYC、NBN、NF1、PDGFRA、PTEN、RET、ROS1、TP53、VEGFA和VHL。見(jiàn)表2，圖1。

圖1 108 例STS 患者NGS 基因變異次數(shù)及臨床治療意義

108 例患者中，7 例（6.5%）患者的基因突變符合臨床指南建議，受益率最高的組織學(xué)亞型為脂肪肉瘤46.2%（6/13）；31 例（28.7%）符合超適應(yīng)證治療，受益率最高的組織學(xué)亞型為惡性外周神經(jīng)鞘腫瘤66.7%（2/3）和透明細(xì)胞肉瘤66.7%（2/3）；56 例（51.9%）符合臨床試驗(yàn)招募，受益率最高的組織學(xué)亞型為纖維肉瘤85.7%（6/7）。62 例（57.4%）符合臨床指南建議、超適應(yīng)證治療或臨床試驗(yàn)招募，受益率最高的組織學(xué)亞型為纖維肉瘤85.7%（6/7），見(jiàn)表1，圖2。

2.3 TMB

108 例STS 患者的TMB 中位值為2.42（0～60）muts/Mb，其中10 例（9.3%）TMB 值≥10 muts/Mb，24例（22.2%）TMB 值5 ～10 muts/Mb，74 例（68.5%）TMB 值<5 muts/Mb。其中，TMB 值≥10 muts/Mb 發(fā)生率前3 位的組織學(xué)亞型為上皮樣肉瘤33.3%（1/3）、炎性肌纖維母細(xì)胞瘤33.3%（1/3）和滑膜肉瘤15.8%(3/19)，見(jiàn)表3。

2.4 MSI 狀態(tài)

89 例患者接受了MSI 狀態(tài)檢測(cè)，其中MSI-H 1例（1.1%），組織學(xué)亞型為透明細(xì)胞肉瘤，MSI=0.133；MSI-L 3 例（3.4%），包括2 例橫紋肌肉瘤（MSI=0.091，MSI=0.051）和1 例未確定亞型的軟組織肉瘤（MSI=0.067）；其余85 例均為MSS。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，軟組織肉瘤常見(jiàn)的基因變異與既往文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。Lucchesi 等[5]通過(guò)NGS 對(duì)584例成人STS 患者的基因型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，按基因突變的檢出頻次排序，發(fā)生改變最多的20 個(gè)基因?yàn)門(mén)P53、MDM2、CDK4 、RB1 、ATRX 、CDKN2A 、PTEN、NF1、CDKN2B 、KMT2D 、GLI1 、ATM 、TERT、PI3KCA、NOTCH1 、MAP2K4 、ERBB4 、ARID1A、TSC2 和TNFAIP3。不同中心的檢測(cè)結(jié)果存在一定差異，分析原因可能與入選的肉瘤亞型相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)TP53 的突變檢出頻次最高。TP53 突變尤其好發(fā)于平滑肌肉瘤、血管肉瘤和多形性脂肪肉瘤等復(fù)雜核型的肉瘤，但是在滑膜肉瘤、透明細(xì)胞肉瘤及腺泡狀軟組織肉瘤等具有明確融合型驅(qū)動(dòng)基因的肉瘤中并不常見(jiàn)。其他基因變異部分好發(fā)于特定亞型中，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

2018年紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心（MSKCC）使用NGS 技術(shù)檢測(cè)對(duì)來(lái)自世界各地5 635 例STS 患者進(jìn)行了回顧性分析，其中在542 例（9.6%）患者的已知和新發(fā)現(xiàn)的基因中觀察到可疑的胚系缺陷突變。其中16%的患者可以對(duì)應(yīng)到美國(guó)FDA 已批準(zhǔn)的藥物，7%的患者可以對(duì)應(yīng)到臨床試驗(yàn)研究階段的藥物。42%的患者符合臨床試驗(yàn)招募條件[6]。本研究中57.4%的患者符合臨床指南建議、超適應(yīng)證治療或臨床試驗(yàn)招募，高于文獻(xiàn)報(bào)道。分析原因可能是因?yàn)楸狙芯繑?shù)據(jù)大多來(lái)源于近幾年，隨著基礎(chǔ)研究的深入和臨床試驗(yàn)的快速跟進(jìn)，患者實(shí)際獲益率更高。但本研究中僅有6.5%的患者基因突變符合臨床指南建議而獲得了指導(dǎo)性治療，此數(shù)值低于文獻(xiàn)報(bào)道。其中，使用帕博西尼治療CDK4 或CDK6 基因突變的脂肪肉瘤患者屬于指南建議，但是其他瘤種在CDK4 或CDK6基因突變的情況下卻屬于超適應(yīng)證用藥。這可能也是本研究中符合臨床指南建議獲益較低的原因。

表2 存在臨床治療意義的基因變異概況

表2 存在臨床治療意義的基因變異概況 （續(xù)表2）

表2 存在臨床治療意義的基因變異概況 （續(xù)表2）

圖2 存在臨床治療意義的基因變異在62 例STS 患者中的分布情況

表3 108 例STS 患者各亞型TMB 值

超適應(yīng)證治療指超出藥品的使用說(shuō)明書(shū)所表明的適應(yīng)證、給藥路徑和劑量。有研究提示[7]，美國(guó)大約20%超適應(yīng)證使用在規(guī)范的臨床研究之后，可以推動(dòng)臨床治療方案。如帕唑帕尼作為多靶點(diǎn)小分子受體酪氨酸激酶抑制劑，早期的適應(yīng)證為晚期腎細(xì)胞癌患者，被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)為首個(gè)治療晚期軟組織肉瘤（非脂肪肉瘤）的靶向藥物[8]。本研究發(fā)現(xiàn)有28.7%患者通過(guò)NGS 檢測(cè)后符合藥物超適應(yīng)證治療，其中受益率最高的組織學(xué)亞型為惡性外周神經(jīng)鞘瘤和透明細(xì)胞肉瘤。目前，晚期惡性外周神經(jīng)鞘瘤一線(xiàn)治療方案仍是蒽環(huán)類(lèi)為主的化療，而透明細(xì)胞肉瘤無(wú)明確有效的藥物。二者除了廣譜的血管生成抑制劑，尚無(wú)明確專(zhuān)門(mén)針對(duì)此組織學(xué)亞型的靶向藥物。因此，建議這類(lèi)亞型患者進(jìn)行NGS 檢測(cè)，可能獲取更多的臨床治療提示。值得關(guān)注的是，醫(yī)生在超適應(yīng)證用藥前應(yīng)該與患者充分溝通藥物的有效性、安全性、存在的風(fēng)險(xiǎn)和沒(méi)有適應(yīng)證等情況，獲得患者的書(shū)面知情同意。

臨床試驗(yàn)方面，受試者的獲益是指研究對(duì)受試者具有診斷、治療或預(yù)防的直接益處。本研究中有51.9%的患者符合臨床試驗(yàn)招募，受益率最高的組織學(xué)亞型為纖維肉瘤。雖然現(xiàn)階段針對(duì)STS 的指南并沒(méi)有明確推薦多線(xiàn)治療失敗的患者參加臨床試驗(yàn)，但是很多其它瘤種指南都肯定了臨床試驗(yàn)的治療意義，如黑色素瘤臨床指南中建議Ⅱ期以上的惡性黑色素瘤患者可以選擇參加臨床試驗(yàn)作為輔助治療策略[9]。需要提及的是，臨床試驗(yàn)存在一定風(fēng)險(xiǎn)，患者有可能受益，但也有可能受損，患者本身也要承受藥物研究失敗的風(fēng)險(xiǎn)。

伴隨著DNA 測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，TMB 檢測(cè)已成為一種常見(jiàn)的技術(shù)，TMB 作為生物標(biāo)志物對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）療效預(yù)測(cè)的作用在多項(xiàng)臨床研究中得到證實(shí)。TMB 值越高，患者接受ICIs 治療后的整體生存率越高[10]。但是，不同類(lèi)型惡性腫瘤的TMB 值水平差別很大，而且對(duì)于高TMB 的定義并無(wú)統(tǒng)一的閾值。Chalmers 等[11]通過(guò)100 000 個(gè)人類(lèi)基因組描述了TMB 在不同惡性腫瘤病例中的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)STS 的TMB 水平在所有惡性腫瘤中處于較低水平，中位TMB 為2.5 muts/Mb，僅高于胰腺癌。本次研究發(fā)現(xiàn)全組108 例STS 患者的TMB 值為2.42（0～60）muts/Mb，這與既往報(bào)道結(jié)果一致。但是針對(duì)STS 目前尚無(wú)高級(jí)別的研究證據(jù)表明免疫治療的治療效果與TMB 水平相關(guān)[12]，而已知的對(duì)ICIs 反應(yīng)率較高的腺泡狀軟組織肉瘤反而是TMB 最低的亞型之一。因此，對(duì)于晚期STS 是否接受ICIs 治療，TMB 值僅能做為參考指標(biāo)之一，需要結(jié)合肉瘤亞型及PD-L1 表達(dá)水平等其他因素綜合評(píng)估。

MSI-H 癌細(xì)胞相比于MSS 正常癌細(xì)胞更易累積突變，產(chǎn)生大量異源抗原，可能更容易被免疫T 細(xì)胞識(shí)別。近年來(lái)，隨著免疫檢查點(diǎn)抑制劑的使用，發(fā)現(xiàn)MSI-H 的多種實(shí)體瘤對(duì)程序性死亡受體-1（programmed death-1，PD-1）及其配體（PD-L1）單抗效果比較好。帕博麗珠單抗獲美國(guó)FDA 批準(zhǔn)用于治療MSI-H/錯(cuò)配修復(fù)缺陷（different mismatch repair，dMMR）的實(shí)體瘤患者，是美國(guó)FDA 首次不依照癌種而是依照生物標(biāo)志物核批的抗腫瘤療法[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，MSI-H 發(fā)生率很低，僅為1.1%，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似（0.78%）[14]。目前，暫無(wú)大宗的病例報(bào)道MSI 狀態(tài)與PD-1 單抗治療STS 療效的關(guān)系。因此，MSI 檢測(cè)的意義還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究存在一定局限性。首先，由于STS 的亞型眾多，部分罕見(jiàn)肉瘤亞型的樣本量相對(duì)比較小，因此很難統(tǒng)計(jì)出相對(duì)特異的高頻變異，需要通過(guò)綜合多中心、多平臺(tái)的檢測(cè)數(shù)據(jù)才可能發(fā)現(xiàn)一定的規(guī)律。其次，部分STS 存在特征性的染色體易位，例如滑膜肉瘤的SS18-SSX，Ewing 肉瘤的EWSR1-FLI1、透明細(xì)胞肉瘤的EWSR1-ATF1 等，這些變異通過(guò)常規(guī)的DNA 高通量測(cè)序一般都很難被發(fā)現(xiàn)。為了解決這一問(wèn)題，部分檢測(cè)平臺(tái)已經(jīng)添加了針對(duì)這些融合基因的RNA 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq），可敏感地發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在的融合基因，從而為STS 的診斷與鑒別診斷提供重要信息。但是，由于針對(duì)這些融合基因目前并沒(méi)有特異性的靶向藥物，RNA-seq 技術(shù)在治療方面的價(jià)值還有待商榷。其次，由于統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)有限，本研究發(fā)現(xiàn)的這些基因變異位點(diǎn)是錯(cuò)義突變還是無(wú)義突變未予列出。最后，本研究列出的基因變異未按分子通路形式予以歸納，其相關(guān)性仍需進(jìn)一步探究。既往文獻(xiàn)報(bào)道STS 患者中TP53-MDM2/MDM4-CDKN2A 通路、CDKN2A/CDK4/RB1 通路以及RAS/NF1/PTEN/PI3K 通路變異頻率最高，這些STS 患者存在潛在用藥靶點(diǎn)[15]。

綜上所述，雖然通過(guò)NGS 檢測(cè)僅能在部分STS患者中找到有臨床治療意義的基因變異靶點(diǎn)，但是由于晚期STS 患者的治療手段非常有限，NGS 檢測(cè)仍然具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。隨著醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)步和NGS 檢測(cè)平臺(tái)的完善，將來(lái)有可能使更多的患者獲益。