黃艷琴，袁佳蕾，余艷容，彭珊珊，張 詠，郭紅燕，胡銀英

(1.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗腫瘤研究室； 2.江西省中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，南昌330006)

樹突狀細(xì)胞(DC)是專職的抗原提呈細(xì)胞,IDO在其內(nèi)的表達(dá)可抑制DC的表型和功能，主要表現(xiàn)為對細(xì)胞因子的反應(yīng)降低,進(jìn)而抑制T細(xì)胞的免疫反應(yīng)[1]。傳統(tǒng)的體外修飾DC的抗腫瘤疫苗通常采用腫瘤實體抗原、合成的腫瘤抗原致敏DC，以及腫瘤相關(guān)基因修飾DC，其雖有一定的抗腫瘤作用，但依然存在不足，如DC功能障礙、DC無能等[2]。因此，提高DC抗腫瘤的能力，完善DC疫苗的治療效果是學(xué)者們共同關(guān)心的熱點。人參皂苷Rg3是一種已被確認(rèn)具有明顯抗腫瘤作用的人參活性單體成分[3]。本研究采用人參皂苷Rg3作用小鼠腎癌RAG細(xì)胞株裂解物致敏的DC，探討人參皂苷Rg3增強(qiáng)DC的抗原提呈能力，以及激活CTL抗腫瘤的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

SPF級別C57BL/6小鼠，雄性，體重16～18 g，周齡6～8周，SPF級別BALB/C小鼠，雄性，體重16～18 g，周齡6～8周，購自湖南長沙斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司；小鼠腎癌細(xì)胞RAG細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。人參皂甙Rg3純度>99%購自大連福生制藥廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 DC的誘導(dǎo)與培養(yǎng)

將C57小鼠脫頸椎處死，浸泡于碘伏液消毒5 min；無菌狀態(tài)下取雙側(cè)股骨，離斷骺端，用注射針頭破壞骨小梁后用無血清1640液反復(fù)抽吸沖洗髓腔，收集骨髓懸液，用0.5 mL紅細(xì)胞裂解液重懸破壞紅細(xì)胞，室溫下靜置5 min,加無血清1640稀釋，離心洗滌2遍，棄上清，用10%FBSRPMI1640±20 ng·mL-1、GM-CSF±20 ng·mL-1IL-4 DC誘導(dǎo)培養(yǎng)體系重懸細(xì)胞，分別加入Rg3，進(jìn)行實驗分組，隔天進(jìn)行半量換液。

1.2.2 實驗分組

1)Control組(C組):普通DC誘導(dǎo)培養(yǎng)體系；2)G10組：DC誘導(dǎo)培養(yǎng)體系加人參皂苷Rg3至10 μg·mL-1；3)G20組：DC誘導(dǎo)培養(yǎng)體系加人參皂苷Rg3至20 μg·mL-1；4)G50組：DC誘導(dǎo)培養(yǎng)體系加人參皂苷Rg3至50 μg·mL-1。

1.2.3 DC的形態(tài)學(xué)觀察及表型鑒定

倒置顯微鏡下觀察DC生長過程及形態(tài)變化；收集培養(yǎng)6、9、11 d后DC，4組分別用0.01 M PBS洗滌2次，用200 μL 0.01 M PBS溶液重懸，而后各加5 μL anti-CD11c PE、anti-CD80PE-Cy5和anti-CD86 PE、MHC-Ⅱ-FITC，C組不加抗體；混合后4 ℃ 冰箱中避光反應(yīng)半小時，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣品測定分析。

1.2.4 RAG抗原致敏Rg3-DC

將對數(shù)生長期的小鼠腎癌細(xì)胞(RAG)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107mL-1，置液氮反復(fù)凍融6次后制備成腫瘤抗原，加入培養(yǎng)5 d的Rg3-DC細(xì)胞中，溶度為100 μg·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集DC細(xì)胞懸液，PBS洗滌3次，此細(xì)胞即為RAG抗原致敏Rg3-DC。

1.2.5 提取總RNA，QPCR檢測IDO的表達(dá)效率

收集經(jīng)RAG抗原致敏后各組Rg3-DC細(xì)胞，提取總RNA，QPCR檢測IDO的表達(dá)[4]。

1.2.6 RAG抗原致敏Rg3-DC誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖與激活實驗

從BALB/C小鼠脾臟分離出T淋巴細(xì)胞，致敏Rg3-DC計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度，使致敏Rg3-DC和T細(xì)胞比分別為：1:10、1:50、1:100，加入96孔板中共培養(yǎng)，100 μL·孔-1,每組設(shè)個3復(fù)孔，并設(shè)刺激細(xì)胞對照孔(只加致敏Rg3-DC,100 μL·孔-1)和反應(yīng)細(xì)胞對照孔(只加T細(xì)胞100 μL·孔-1)。96孔板置37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，72 h后取出96孔培養(yǎng)板，加入含有10 μL CCK-8的培養(yǎng)液100 μL，置孵箱中孵育4 h后，在波長490 nm處測其OD值，計算致敏Rg3-DC對CTL細(xì)胞增殖的影響，并優(yōu)選出DC/T混合培養(yǎng)的最佳比例；收集DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液，用ELISA試劑盒檢測IL-12、IFN-γ表達(dá)水平。

1.2.7 CCK-8法

采用CCK-8法檢測CTL對靶細(xì)胞的殺傷能力。收集經(jīng)RAG抗原致敏Rg3-DC激活各組T細(xì)胞(選擇DC/T 1:10混合培養(yǎng)的比例)，各組計數(shù)定量，取對數(shù)生長期的(RAG)與T細(xì)胞比分別為：1:10、1:20、1:40，各50 μL加入96孔板，37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，24 h后加入含有10 μLCCK8的培養(yǎng)液100 μL，置孵箱中孵育4 h后，在波長490 nm處測其OD值[5]。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DC表面分子標(biāo)志物鑒定

DC培養(yǎng)至6 d時，大多數(shù)細(xì)胞表面出現(xiàn)突起，細(xì)胞培養(yǎng)液中可見少許較大體積的懸浮細(xì)胞，表面粗糙，有明顯絲狀突起，G10、G20、G50組可看見更明顯變化。

用FCM檢測DC表面分子標(biāo)志物結(jié)果顯示，MHC-Ⅱ的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CD80的表達(dá)：6 d時隨著人參皂苷Rg3的濃度的增加而上升，9 d時Rg3 20 μg·mL-1作用濃度下CD80的表達(dá)最高(P<0.05)；CD86的表達(dá)：在Rg3 20 μg·mL-1作用濃度下達(dá)到高峰，且在培養(yǎng)9 d時達(dá)到最高值；CD11c的表達(dá)：G50組在6、9 d時高于其他3組，11 d時低于其他3組；在6 d時G20組高于C組和C10組，11 d時G20組低于于C組和C10組。表1—4。

表1 表1 各組不同時間點DC細(xì)胞的MHCⅡ表達(dá)率

表2 各組不同時間點DC細(xì)胞的CD86表達(dá)率

表3 各組不同時間點DC細(xì)胞的CD80表達(dá)率

表4 各組不同時間點DC細(xì)胞的CD11c表達(dá)率

2.2 DC細(xì)胞中IDO的表達(dá)及沉默

取培養(yǎng)6 d后抗原致敏的人參皂苷Rg3-DC細(xì)胞檢測IDO的表達(dá)，QPCR結(jié)果顯示，G10、G20組人參皂甙Rg3，明顯低于C組(P<0.05)；C組與G50組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 Rg3誘導(dǎo)后的DC細(xì)胞IDO表達(dá)

2.3 Rg3-DC對CTL細(xì)胞增殖作用

Rg3-DC與同種異體小鼠脾臟T細(xì)胞混合培養(yǎng)，通過CCK-8檢測結(jié)果，篩選出DC與T細(xì)胞最佳混合培養(yǎng)的比例為1:10，G10、G20、G50組Rg3-DC與T細(xì)胞混合培養(yǎng)72 h后，CCK-8檢測各組淋巴細(xì)胞，以證實其濃度關(guān)系。結(jié)果顯示：與C組相比G10、G20組淋巴細(xì)胞增殖明顯增多(P<0.05);C組與G50組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

表6 各組CTL細(xì)胞的OD值

2.4 Rg3-DC對CTL細(xì)胞免疫功能的影響

用ELISA法檢測上述混合細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12、IFN-γ表達(dá)水平，結(jié)果顯示各組IL-12、IFN-γ的表達(dá)水平隨著Rg3濃度的升高而升高(P<0.05)。見表7—8。

表7 各組CTL細(xì)胞IL-12的表達(dá)水平

表8 各組IFN-γ的表達(dá)水平

2.5 CTL對體外培養(yǎng)的RAG細(xì)胞的殺傷作用

根據(jù)CCK-8結(jié)果，設(shè)置DC:T比為1:10，Rg3-DC誘導(dǎo)CTL細(xì)胞與RAG細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)同一效靶比時，Rg3-DC誘導(dǎo)G10、G20、G50組殺傷腫瘤的能力明顯強(qiáng)于C組，其中G20組的殺傷能力最高(P<0.05)。見表9。

表9 Rg3-DC誘導(dǎo)的CTL對腎癌細(xì)胞的抑制率

3 討論

人參皂甙Rg3是人參的有效成分，為我國開發(fā)并擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的第一個中藥單體Ⅰ類抗癌新藥。Rg3具有抗氧化、抗炎和抗癌活性，對腫瘤細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡、抑制增殖、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等作用[2，6]。Rg3能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[7-8]，選擇性抑制腫瘤細(xì)胞黏附和浸潤，抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[9-10]，抑制腫瘤新生血管形成[11-13]，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[14-15]，增強(qiáng)腫瘤化療患者外周血淋巴細(xì)胞的免疫功能,升高其外周血NK細(xì)胞的表達(dá)活性,增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能等作用[16]，因此，被認(rèn)為是一種免疫增強(qiáng)劑。前期研究[17]也證實,人參皂甙Rg3具有促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分化成熟及刺激淋巴細(xì)胞的增殖等作用，并能誘導(dǎo)NKM45人胃癌細(xì)胞凋亡。

DC是一種功能極強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，在免疫應(yīng)答中居于重要地位[16]。因此，當(dāng)機(jī)體免疫系統(tǒng)被激活時，DC促進(jìn)機(jī)體生成CTL細(xì)胞和Th細(xì)胞，并產(chǎn)生免疫應(yīng)答。由DC激活的CTL介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答對惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后發(fā)揮著極其重要的作用。DC功能缺陷或數(shù)量減少均與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[18]，當(dāng)腫瘤患者體內(nèi)可能存在DC分化成熟障礙，導(dǎo)致DC在細(xì)胞因子表達(dá)、激活T細(xì)胞增殖及成功誘導(dǎo)CTL等方面出現(xiàn)程度不同的功能缺陷。

IDO是一種免疫調(diào)節(jié)酶,可催化色氨酸分子中吲哚環(huán)氧化裂解,從而沿犬尿酸途徑分解代謝，DC是唯一能夠激活初始型T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，但LPS或者TNF-α等可刺激其表達(dá)IDO,并通過降解色氨酸,使局部組織中的色氨酸耗竭,代謝產(chǎn)物犬尿氨酸含量增加,從而抑制T細(xì)胞的增殖,故DC表面表達(dá)IDO可能在誘導(dǎo)免疫逃逸中起著重要的作用[19-20]，提示優(yōu)化DC是提高DC抗原提呈功能的有效措施。本研究用Rg3聯(lián)合細(xì)胞因子下調(diào)DC中的IDO表達(dá)，促進(jìn)DC成熟，使得DC捕捉抗原的能力及激活CTL的能力增強(qiáng)，結(jié)果顯示，隨著Rg3濃度的升高CTL對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用也越來越高，其機(jī)制可能是Rg3誘導(dǎo)DC有效地提呈抗原給CTL細(xì)胞，使CTL細(xì)胞所分泌的促使CTL細(xì)胞分泌抗腫瘤細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12，再進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞克隆增殖，強(qiáng)化Thl型免疫應(yīng)答反映抑制腫瘤的生長。本實驗檢測到Rg3誘導(dǎo)后DC的IDO表達(dá)效率有明顯下降，啟動更加有效的免疫反應(yīng)，故推測Rg3在一定濃度范圍內(nèi)可誘導(dǎo)DC活性增強(qiáng)的具體機(jī)制可能與其引起IDO表達(dá)效率下降有關(guān)。

DC可以高表達(dá)MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子，MHC分子與其捕獲加工的腫瘤抗原結(jié)合，形成肽-MHC分子復(fù)合物，并遞呈給T細(xì)胞，從而啟動MHC-I類限制性CTL反應(yīng)和MHC-Ⅱ類限制性的CD4+Thl反應(yīng)。本實驗中Rg3誘導(dǎo)的DC所表達(dá)的MHC-Ⅱ在前9 d與C組相比都要高，這也說明Rg3促進(jìn)了DC分化，MHC-Ⅱ的增強(qiáng)使DC獲得更強(qiáng)的抗原攝取能力，更有利于刺激CTL的免疫反應(yīng)，因此說明一定濃度的Rg3能夠刺激誘導(dǎo)DC的成熟，能夠更積極地啟動T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。

總之，通過優(yōu)化樹突狀細(xì)胞的靶向和抗免疫逃逸方法制備腫瘤疫苗，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性CTL,為腫瘤患者進(jìn)行主動免疫和過繼性細(xì)胞免疫治療提供實驗數(shù)據(jù)，也為中藥參與腫瘤的生物治療奠定理論基礎(chǔ)。