支文蘭 常君麗 胡少樸 王曉波 趙福來 孫星媛 馬小平 楊燕萍

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，主要起源于長骨干骺端，具有惡性度高、早期易轉(zhuǎn)移和死亡率高等特點(diǎn)［1］。新輔助化療聯(lián)合保肢術(shù)治療可使無轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者5年生存率達(dá)70%［2］，但肺轉(zhuǎn)移患者的5年生存率仍不足30%［3］。然而，20%的骨肉瘤患者確診時(shí)已存在肺轉(zhuǎn)移，且90%有微轉(zhuǎn)移灶［4-5］，因此即使手術(shù)也仍有80%的患者發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移［6］。由此可見，探索骨肉瘤發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的機(jī)制，從而有效控制肺轉(zhuǎn)移是提高骨肉瘤患者生存率的關(guān)鍵［7］。本研究以人源骨肉瘤143B細(xì)胞為親本細(xì)胞，采用GFP和熒光素酶標(biāo)記143B細(xì)胞后注射到4周齡BALB/c裸鼠脛骨內(nèi)，建立脛骨內(nèi)原位注射肺轉(zhuǎn)移瘤模型，同時(shí)建立了一株具有高度肺轉(zhuǎn)移能力的骨肉瘤細(xì)胞亞系143B-HLM，為后續(xù)探索骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素購自美國Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）、新霉素（G418）購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自瑞典Medicago公司；RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、HRP-標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP-標(biāo)記山羊抗鼠IgG購自碧云天公司；波形蛋白（Vimentin）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Slug）、β-actin抗體購自英國Abcam公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；pENTER-EGFP質(zhì)粒、plv-lu-ciferase熒光素酶質(zhì)粒購自美國Genomeditech公司；小動物生物發(fā)光活體成像系統(tǒng)購自美國Perkin Elmer公司；xCELLigenceRTCADP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀購自德國Roche公司；稱重儀、游標(biāo)卡尺購自上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 細(xì)胞系來源與培養(yǎng)

人源骨肉瘤細(xì)胞系143B（ATCC?CRL-8303TM）購自美國ATCC公司細(xì)胞庫，用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 動物來源與飼養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)使用的4周齡、雄性裸鼠（BALB/c-nude）購于杭州子源實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司［許可證號：SCXK（浙）2019-0004］，共12只，每組6只。動物實(shí)驗(yàn)獲上海中醫(yī)藥大學(xué)動物管理和委員會批準(zhǔn)，符合實(shí)驗(yàn)動物倫理規(guī)范（動物倫理批號：PZSHTCM200731014），嚴(yán)格按照國際實(shí)驗(yàn)動物相關(guān)要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有裸鼠均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級飼養(yǎng)室。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與抗性篩選

將250μL無血清無抗生素MEM培養(yǎng)基分別與5 μg pENTER-EGFP 質(zhì)粒、plv-luciferase熒光素酶質(zhì)粒混合，同時(shí)將250 μL無血清無抗生素MEM培養(yǎng)基與3 μL LipofectamineTM2000混合 5 min，靜置15 min后，加入在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)24 h的143B細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染72 h后棄去含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，用無菌PBS沖洗2遍、經(jīng)胰蛋白酶消化后將細(xì)胞接種到100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入含300 μg/mL G418的篩選培養(yǎng)基，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，2～3 d更換1次新鮮篩選培養(yǎng)基，直至除去所有G418陰性細(xì)胞，然后更換含低濃度G418的培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，常規(guī)傳代。

1.5 建立143B細(xì)胞脛骨內(nèi)原位注射肺轉(zhuǎn)移瘤模型

收集處于對數(shù)生長期、細(xì)胞融合度約為80%的GFP和熒光素酶標(biāo)記的143B細(xì)胞，重懸到MEM培養(yǎng)基并與Matrigel膠按1∶1的比例均勻混合，制成濃度為1×107/mL的細(xì)胞懸液。取10 μL注射到裸鼠的左側(cè)脛骨內(nèi)，建立脛骨內(nèi)原位注射肺轉(zhuǎn)移瘤模型。6周后以頸椎脫臼法處死裸鼠，分離原位瘤體及肺轉(zhuǎn)移瘤體。

1.6 小動物生物發(fā)光活體成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測原位及肺轉(zhuǎn)移瘤生長

接種骨肉瘤細(xì)胞6周后，用生理鹽水稀釋的D-熒光素鉀鹽（15 mg/kg）注射至腹腔15 min后，吸入異氟烷氣體麻醉裸鼠，用小動物生物發(fā)光活體成像系統(tǒng)觀察脛骨內(nèi)原位注射骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移瘤模型中原位及肺轉(zhuǎn)移骨肉瘤的生長狀況，采用Xenogen Bioluminescent Images V2.50.1軟件定量分析腫瘤體積。

1.7 肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)分離與G418陽性細(xì)胞篩選

將GFP和熒光素酶標(biāo)記的143B細(xì)胞接種于裸鼠脛骨內(nèi)，6周后，用小動物生物發(fā)光活體成像系統(tǒng)觀察確認(rèn)裸鼠模型原位腫瘤形成，同時(shí)遮蓋原位腫瘤的熒光信號，確認(rèn)裸鼠模型出現(xiàn)明顯的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。出現(xiàn)明顯肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)后處死裸鼠，解剖分離整體肺，在顯微鏡的明視場及熒光下對肺組織中的骨肉瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)進(jìn)行機(jī)械分離。切碎后用預(yù)冷的無菌PBS沖洗3次，膠原酶A（1 mg/mL）于37 ℃下消化30 min，加入0.025%胰蛋白酶繼續(xù)在37℃中消化20 min，制備單細(xì)胞懸液，離心保留細(xì)胞沉淀，并接種于含G418的完全培養(yǎng)基，然后進(jìn)行抗性篩選和擴(kuò)增。以同樣的方法再次接種于裸鼠脛骨內(nèi)，經(jīng)分離、篩選和擴(kuò)增，將經(jīng)過2次體內(nèi)循環(huán)獲得的細(xì)胞命名為143B-HLM，詳細(xì)操作流程見圖1。

圖1 建立高肺轉(zhuǎn)移骨肉瘤細(xì)胞系143B-HLM的流程示意圖Fig.1 Flowchart of the process of establishing a high lung metastasis osteosarcoma cell line 143B-HLM

1.8 xCELLigence RTCADP多功能實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞遷移能力

在xCELLigenceRTCADP實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀匹配的CIM-Plate板下室按 165 μL/孔添加細(xì)胞趨化液（含10%FBS的完全培養(yǎng)基），上室按40 μL/孔添加無血清培養(yǎng)基，組裝上下室，37℃孵育30 min平衡后，將100 μL用無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞（2×105/mL）接種到上室，室溫靜置30 min后上機(jī)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。

1.9 Western blot檢測蛋白表達(dá)

采用預(yù)冷的PBS沖洗在10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿貼壁生長的143B及143B-HLM細(xì)胞2次，每個(gè)培養(yǎng)皿加入500 μL的RIPA裂解液，在冰上裂解20 min后，提取總蛋白質(zhì)，并用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度。將等質(zhì)量（20 μg）蛋白質(zhì)與上樣緩沖液按1∶1比例混勻后，在100℃下變性5 min，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜90 min。用快速封閉液封閉15 min，加入一抗Vimentin（1∶1 000）、Slug（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000），4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次（5 min/次），加入二抗HRP-標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP-標(biāo)記山羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次（5 min/次）。按1∶1比例配制ECL顯影液，在Bio-rad成像分析儀上曝光，分析蛋白質(zhì)條帶。

1.10 RT-qPCR檢測目的基因mRNA的相對表達(dá)量

采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA后，紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度，按照37℃15 min、85℃5 min的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，于4℃下保存。以cDNA產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：4 μL 5×Buffer，1 μL Enzyme mix，1 μL OligdT primer，1 μL Random primer，1.4 μL RNA（total），11.6 μL DEPC。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95℃10 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2?△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 143B-HLM細(xì)胞對裸鼠體內(nèi)骨肉瘤生長的影響

為檢測143B-HLM細(xì)胞對體內(nèi)骨肉瘤生長的影響，收集處于對數(shù)生長期的143B細(xì)胞和143B-HLM細(xì)胞，在裸鼠脛骨髓腔內(nèi)注射骨肉瘤細(xì)胞（1×105個(gè)/只）制備脛骨內(nèi)原位注射肺轉(zhuǎn)移瘤模型，造模第2天開始每周測量1次腫瘤體積與裸鼠體重，42 d后將所有裸鼠安樂死。研究結(jié)果顯示，注射143B-HLM細(xì)胞的裸鼠腫瘤體積較注射143B細(xì)胞的裸鼠明顯減?。╰=3.889，P=0.007，圖2A～B），但裸鼠體重未受明顯影響（t=1.109，P=0.30，圖2C），且兩組裸鼠均無死亡現(xiàn)象。

圖2 143B-HLM細(xì)胞對裸鼠體內(nèi)骨肉瘤生長的影響Fig.2 Effect of 143B-HLM cells on the growth of osteosarcoma in vivo

2.2 143B-HLM細(xì)胞在體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)

在熒光顯微鏡下觀察解剖離體肺，確定每組裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)生長情況。結(jié)果顯示，與143B細(xì)胞制備的肺轉(zhuǎn)移瘤模型比較，143B-HLM細(xì)胞制備的裸鼠模型肺部GFP熒光信號增強(qiáng)（圖3A）；熒光顯微鏡下，平均肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的熒光信號強(qiáng)度顯著增高（t=4.172，P=0.002，圖3B），肺轉(zhuǎn)移的裸鼠數(shù)目也高于143B細(xì)胞組，其中注射143B-HLM細(xì)胞的裸鼠肺轉(zhuǎn)移率為100%，143B組的肺轉(zhuǎn)移率為66.67%（圖3C）。

圖3 倒置熒光顯微鏡下觀察離體肺GFP標(biāo)記的骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況Fig.3 Metastasis of GFP-labeled osteosarcoma cells in isolated lung observed by inverted fluorescence microscopy

2.3 143B-HLM細(xì)胞在體外的遷移能力增強(qiáng)

xCELLigence實(shí)時(shí)細(xì)胞儀監(jiān)測結(jié)果（圖4）顯示，與143B細(xì)胞相比，143B-HLM細(xì)胞的體外遷移能力顯著增強(qiáng)。Westernblot實(shí)驗(yàn)（圖5）顯示，143B-HLM細(xì)胞中Vimentin（t=4.376，P=0.008）和Slug（t=1.376，P=0.032）的蛋白表達(dá)量高于143B細(xì)胞。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)（圖6）結(jié)果顯示，143B-HLM細(xì)胞中Vimentin（t=15.410，P=0.001）、Slug（t=4.467，P=0.001）、Snail（t=3.799，P=0.004）和Survivin（t=2.806，P=0.017）的 mRNA 表達(dá)量均高于143B細(xì)胞。

圖4 xCELLigence實(shí)時(shí)細(xì)胞儀監(jiān)測細(xì)胞遷移能力Fig.4 Cells migration ability detected by xCELLigence real-time cytometry monitoring

圖5 Western blot檢測細(xì)胞中Vimentin和Slug蛋白表達(dá)量Fig.5 Protein expression of Vimentin and Slug detected by Western blot

圖6 RT-qPCR檢測細(xì)胞中Vimentin、Snail、Slug和Survivin的mRNA表達(dá)量Fig.6 The mRNA expression of Vimentin,Snail,Slug and Survivin detected by RT-qPCR

3 討論

骨肉瘤是一種原發(fā)性惡性骨腫瘤，大約20%的病例表現(xiàn)出微轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移腫瘤，其中最常見的是肺轉(zhuǎn)移［8］。因此，對骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移發(fā)病機(jī)制的研究備受關(guān)注［9］，而建立具有高肺轉(zhuǎn)移能力的人骨肉瘤細(xì)胞系，有助于揭示骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制。目前已有此類細(xì)胞，如K7M2和 K12細(xì)胞［10-15］。但是 K7M2和K12細(xì)胞都是小鼠源的骨肉瘤細(xì)胞系，并不能真實(shí)反映人體中的病理狀態(tài)。相比之下，人骨肉瘤細(xì)胞系能更好地反映骨肉瘤患者的臨床特征，也更有利于研究結(jié)果臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。既往研究顯示，相較于其他人骨肉瘤細(xì)胞株MNNG、HOS及TE85，143B細(xì)胞株表現(xiàn)出最強(qiáng)的增殖遷移能力，且143B細(xì)胞致瘤性和轉(zhuǎn)移性較高，但143B細(xì)胞的異種移植動物模型的轉(zhuǎn)移率僅為50%［16］。也有研究通過骨肉瘤細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)體系誘導(dǎo)獲得具有高遷移能力的骨肉瘤細(xì)胞系，并且在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)該細(xì)胞系的遷移能力顯著增強(qiáng)，但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的效果仍不穩(wěn)定［17］。

本研究建立了一株具有高肺轉(zhuǎn)移能力的人源骨肉瘤細(xì)胞系143B-HLM。通過體內(nèi)外檢測發(fā)現(xiàn)，與注射親本143B細(xì)胞的裸鼠相比，注射143B-HLM細(xì)胞的裸鼠更容易形成自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)也更多。此外，與以往研究的小鼠細(xì)胞系或轉(zhuǎn)化的人骨肉瘤細(xì)胞系的動物模型相比，本研究通過體內(nèi)循環(huán)篩選的自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移143B-HLM細(xì)胞構(gòu)建的異種移植模型還可以顯著影響細(xì)胞系中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)。EMT是惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生的特征性“移行態(tài)”表現(xiàn)，是正常上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程［18］。EMT通過介導(dǎo)細(xì)胞遷移和浸潤相關(guān)基因表達(dá)如Vimentin、Snail、鋅指轉(zhuǎn)錄抑制因子（Slug）和調(diào)亡抑制基因（Survivin）等，使細(xì)胞遷移能力及浸潤能力表型增強(qiáng)，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移［19］。EMT還是惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)的初始觸發(fā)因子，在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為此，本研究進(jìn)一步檢測了143B-HLM細(xì)胞中遷移和浸潤相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果顯示Vimentin、Snail、Slug和 Survivin在 143B-HLM 細(xì)胞中的表達(dá)水平均升高，推測這些表型的改變可能使143B-HLM細(xì)胞獲得比143B細(xì)胞更容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的能力。

綜上所述，人骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞通過在裸鼠體內(nèi)循環(huán)篩選及分離后，再經(jīng)脛骨內(nèi)原位注射建立的肺轉(zhuǎn)移人源骨肉瘤細(xì)胞系具有較好的肺轉(zhuǎn)移能力，可為探索骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制提供有效的細(xì)胞模型，同時(shí)為探索骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移早期診斷、預(yù)防和治療新的分子靶標(biāo)奠定基礎(chǔ)。