關(guān)滄海 劉浪 史武江 王健崗 鐘翔宇 姜興明

膽管癌是膽道系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤，根據(jù)發(fā)生部位的不同主要分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌兩類，據(jù)統(tǒng)計(jì)膽管癌患者的5年生存率不足30%，其原因包括患者早期癥狀不明顯、腫瘤解剖位置不易獲得以及缺乏特異性分子標(biāo)志物等［1-2］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類大于200個(gè)核苷酸的幾乎不能編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本，微小RNA（microRNA，miRNA）是一種長(zhǎng)度為 20～24個(gè)核苷酸的小單鏈非編碼RNA。目前許多l(xiāng)ncRNA和miRNA已被證明在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2-5］。其中l(wèi)ncRNA小核仁RNA宿主基因20（small nucleolar RNA host gene 20，SNHG20）最早在肝細(xì)胞癌研究中被發(fā)現(xiàn)［6］。而miR-520f-3p是一種腫瘤相關(guān)miRNA，目前已被證實(shí)在膠質(zhì)瘤和肝癌中發(fā)揮抑癌作用［7-8］，但是在膽管癌中 SNHG20 和 miR-520f-3p的關(guān)系及其臨床價(jià)值和生物學(xué)作用尚未闡明。本研究探討lncRNA SNHG20和miR-520f-3p對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的調(diào)控及機(jī)制，以期為膽管癌診斷和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

收集哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2012年3月至2014年3月收治的20例膽管癌患者腫瘤組織及相應(yīng)癌旁正常組織，所有組織均經(jīng)病理學(xué)診斷。所有患者術(shù)前均未接受放化療。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象知情同意。

人正常膽管上皮細(xì)胞系HIBEC和膽管癌細(xì)胞系CCLP-1、QBC939、RBE、TFK-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、TRIzol試劑盒和LipofectamineTM3000均購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；si-NC、si-SNHG20、miR-NC、miR-520f-3p mimics、inh-NC和 miR-520f-3p inhibitor由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Master mix試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒和CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

膽管癌細(xì)胞 CCLP-1、QBC939、RBE、TFK-1和膽管上皮細(xì)胞HIBEC在37℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至70%匯合度時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)（傳代時(shí)間不超過(guò)6個(gè)月）。轉(zhuǎn)染前將膽管癌細(xì)胞CCLP-1接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)40%～50%時(shí)，按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)的方法分別將 si-SNHG20、si-NC、miR-520f-3p mimics、miR-NC、miR-520f-3p inhibitor和 inh-NC轉(zhuǎn)染至 CCLP-1 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)

用TRIzol試劑盒提取上述細(xì)胞的總RNA，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用SYBR Green Master mix試劑盒和C1000熱循環(huán)儀進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，選取GAPDH和U6分別作為SNHG20和miR-520f-3p的內(nèi)參。引物序列如下：SNHG20上游為 5'-ATGGCTATAAATAGATACACGC-3'，下游為 5'-GGTACAAACAGGGAGGA-3'；miR-520f-3p上游為5'-GCCGAGAAGTGCTTCCTTTTA -3'，下游為5'-CT-CAACTGGTGTCGTGGA-3'；GADPH 上游為 5'-GGG-AGCCAAAAGGGTCAT-3'，下游為 5'-GAGTCC-TTC-CACGATACCAA-3'；U6上游為5'-GCTTCGGCAGCA-CATATACTAAAAT-3'，下游為 5'-CGCTTCACGAATT-TGCGTGTCAT-3'。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 10 min，95 ℃12 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。所有檢測(cè)均在96孔板進(jìn)行，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2?△△Ct法對(duì)目的基因進(jìn)行表達(dá)量相對(duì)定量分析。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

將轉(zhuǎn)染后呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，用胰酶消化后以1 000/孔接種于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，分別在0 h、24 h、48 h和72 h時(shí)向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）值，評(píng)價(jià)細(xì)胞的增殖能力。

1.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以400/孔的濃度接種至6孔板中，加入完全培養(yǎng)基至2 mL后搖勻。培養(yǎng)14 d后，用多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫溶液染色30 min，然后拍照、計(jì)數(shù)，觀察各組細(xì)胞的克隆形成能力。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力

將5×105個(gè)轉(zhuǎn)染相應(yīng)載體的CCLP-1細(xì)胞接種至6孔板，細(xì)胞融合度達(dá)90%后，用直尺和槍頭在板中劃線，用PBS洗3次后加入無(wú)血清培養(yǎng)基。分別在培養(yǎng)0 h和24 h時(shí)用熒光倒置顯微鏡觀察劃痕距離。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

預(yù)先在Transwell小室上層鋪一層Matrigel基質(zhì)膜，將轉(zhuǎn)染后濃度為1×105/mL的細(xì)胞懸液（200 μL）接種于Transwell上室，并在下室加入800 μL含10%血清的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室并用棉簽輕輕擦去上室殘留的細(xì)胞，甲醛固定30 min，0.1%的結(jié)晶紫染色30 min，再利用倒置顯微鏡（×100）觀察侵襲細(xì)胞，3個(gè)復(fù)孔均隨機(jī)選擇3個(gè)視野進(jìn)行拍照與計(jì)數(shù)。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)SNHG20和miR-520f-3p 的靶向作用

利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)StarBase預(yù)測(cè)SNHG20與miR-520f-3p 的互補(bǔ)位點(diǎn)，對(duì) SNHG20 與 miR-520f-3p的結(jié)合序列以及突變后的序列片段進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增后的片段分別插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒中，從而構(gòu)建SNHG20野生型（WT-SNHG20）和突變型（MUT-SNHG20）表達(dá)載體。取CCLP-1細(xì)胞接種至96孔板中，再利用LipofectamineTM3000分別將野生型和突變型SNHG20的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒與 miR-520f-3p mimics和 NC mimics共轉(zhuǎn)染至呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CCLP-1細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法培養(yǎng)48 h，然后檢測(cè)每孔相對(duì)應(yīng)的熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較SNHG20和miR-520f-3p在腫瘤組織和癌旁正常組織的表達(dá)水平；單因素方差分析SNHG20和miR-520f-3p在不同膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的多重比較采用Tukey檢驗(yàn)；兩組獨(dú)立樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以雙側(cè)P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽管癌組織和細(xì)胞系中SNHG20和miR-520f-3p的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于癌旁正常組織，SNHG20在膽管癌組織中明顯高表達(dá)（1.567±0.755vs3.195±1.529，t=4.014，P=0.002），miR-520f-3p 呈低表達(dá)（3.202±0.862vs1.605±1.019，t=3.826，P=0.003），見(jiàn)圖1A～B。與正常膽管上皮細(xì)胞系HIBEC相比，膽管癌細(xì)胞系CCLP-1、QBC939、RBE、TFK-1中SNHG20呈高表達(dá)，其中CCLP-1細(xì)胞的表達(dá)最高（t=26.482，P=0.004）；而 miR-520f-3p在膽管癌細(xì)胞系的表達(dá)水平明顯降低，其中CCLP-1細(xì)胞的表達(dá)最低（t=19.464，P=0.023），見(jiàn)圖1C～D。因此，選擇CCLP-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 SNHG20和miR-520f-3p在膽管癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 Expression of SNHG20 and miR-520f-3p in cholangiocarcinoma tissues and cell lines

2.2 敲低SNHG20能抑制膽管癌CCLP-1細(xì)胞的增殖能力

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，si-SNHG20組CCLP-1細(xì)胞中SNHG20的表達(dá)水平低于si-NC組（t=16.253，P=0.029），見(jiàn)圖2A。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與 si-NC組比較，si-SNHG20 組CCLP-1細(xì)胞在72 h時(shí)的細(xì)胞增殖能力明顯降低（t=14.683，P=0.035），見(jiàn)圖2B；平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-SNHG20組細(xì)胞克隆數(shù)量減少（t=12.936，P=0.002），見(jiàn)圖2C。

圖2 敲低SNHG20對(duì)膽管癌CCLP-1細(xì)胞增殖能力的影響Fig.2 Effect of knocking down SNHG20 on the proliferation of cholangiocarcinoma CCLP-1 cells

2.3 敲低SNHG20能減弱膽管癌CCLP-1細(xì)胞的遷移和侵襲能力

劃痕處理24 h后，與si-NC組比較，si-SNHG20組CCLP-1細(xì)胞遷移能力降低（t=6.356，P=0.026），見(jiàn)圖3A。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與 si-NC 組比較，si-SNHG20組CCLP-1細(xì)胞侵襲能力明顯減弱（t=7.845，P=0.032），見(jiàn)圖3B。

圖3 敲低SNHG20對(duì)膽管癌CCLP-1細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effect of knocking down SNHG20 on the migration and invasion of cholangiocarcinoma CCLP-1 cells

2.4 SNHG20靶向調(diào)控miR-520f-3p

在線數(shù)據(jù)庫(kù)StarBase預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SNHG20和miR-520f-3p存在相同的結(jié)合序列，見(jiàn)圖4A；敲低SN-HG20后，miR-520f-3p在CCLP-1細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高（t=11.633，P=0.048），見(jiàn)圖 4B；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染 miR-520f-3p mimics和WT-SNHG20的CCLP-1細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（t=15.424，P=0.031），見(jiàn)圖4C。

圖4 SNHG20調(diào)控miR-520f-3p的表達(dá)Fig.4 SNHG20 regulated the expression of miR-520f-3p

2.5 沉默miR-520f-3p可逆轉(zhuǎn)敲低SNHG20對(duì)CCLP-1細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-NC+inh-NC組相比，共轉(zhuǎn)染si-SNHG20+inh-NC后miR-520f-3p的表達(dá)明顯升高（t=13.631，P=0.042）；而相比于si-SNHG20+inh-NC 組，si-SNHG20+inh-miR-520f-3p 組 CCLP-1細(xì)胞中 miR-520f-3p的表達(dá)明顯受抑制（t=12.875，P=0.047），見(jiàn)圖5A。CCK-8和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與 si-NC+inh-NC 組相比，共轉(zhuǎn)染 si-SNHG20+inh-NC后CCLP-1細(xì)胞的增殖活力以及侵襲能力明顯降低（t=8.461，P=0.017；t=13.431，P=0.027）；而敲低miR-520f-3p則可以逆轉(zhuǎn)下調(diào)SNHG20對(duì)CCLP-1細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用（t=10.533，P=0.002；t=8.683，P=0.037），見(jiàn)圖5B～C。

圖5 SNHG20通過(guò)調(diào)控miR-520f-3p影響膽管癌細(xì)胞的增殖和侵襲Fig.5 SNHG20 influenced the cells proliferation and invasion of cholangiocarcinoma by regulating miR-520f-3p

3 討論

手術(shù)切除是目前治療膽管癌最有效的手段，但大多數(shù)膽管癌患者直到晚期才被發(fā)現(xiàn)，難以通過(guò)手術(shù)進(jìn)行根治。因此，探索膽管癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制以及有效的分子標(biāo)志物十分必要。lncRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，其中l(wèi)ncRNA SNHG20在多種腫瘤中異常高表達(dá)并通過(guò)多種調(diào)控機(jī)制發(fā)揮促癌作用［9-12］。例如，高表達(dá)SNHG20能夠激活Wnt/β-catenin或EMT信號(hào)通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌的惡性生物學(xué)行為，通過(guò)內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制吸附miR-495和miR-6516-5p方式分別加快乳腺癌和前列腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲遷移［13-16］。此外，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起到重要作用。例如，miR-520f-3p在膠質(zhì)瘤中通過(guò)抑制下游轉(zhuǎn)錄因子TFAP4的表達(dá)從而發(fā)揮抑癌作用［7］。在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子AR通過(guò)調(diào)控miR-520f-3p/SOX9而影響肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為［8］。本研究首先檢測(cè)SNHG20和miR-520f-3p在膽管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)不管在膽管癌組織或膽管癌細(xì)胞中SNHG20和miR-520f-3p均呈異常表達(dá)，其中SNHG20呈高表達(dá)而miR-520f-3p呈低表達(dá)。進(jìn)一步選擇表達(dá)差異最明顯的CCLP-1細(xì)胞進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抑制SNHG20表達(dá)能夠限制CCLP-1細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，包括增殖、遷移和侵襲能力。既往研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可以與下游mRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，miRNA也能直接結(jié)合lncRNA或通過(guò)影響相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)間接調(diào)控lncRNA，從而加快或減慢腫瘤的發(fā)生發(fā)展［17］。因此，本研究通過(guò)生物信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)SNHG20與miR-520f-3p存在相同的結(jié)合位點(diǎn)，miR-520f-3p過(guò)表達(dá)可降低攜帶 WT-SNHG20細(xì)胞的熒光素酶活性，而敲低SNHG20可使CCLP-1細(xì)胞中miR-520f-3p表達(dá)升高，說(shuō)明SNHG20可靶向調(diào)控miR-520f-3p的表達(dá)。本研究進(jìn)一步通過(guò)挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)外源性敲低miR-520f-3p可以逆轉(zhuǎn)沉默SNHG20對(duì)CCLP-1細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明SNHG20在膽管癌中呈高表達(dá)，SNHG20對(duì)膽管癌細(xì)胞增殖和侵襲的促進(jìn)作用與其靶向結(jié)合并下調(diào)miR-520f-3p表達(dá)有關(guān)。然而本研究局限于體外細(xì)胞學(xué)水平，SNHG20/miR-520f-3p調(diào)控膽管癌細(xì)胞增殖的上下游分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探索和研究。