王秀紅，史向遠，張紀濤，王豫霞，李欣欣，周 靜，趙紅葉

（1.山西農(nóng)業(yè)大學山西有機旱作農(nóng)業(yè)研究院，山西太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原 030031；3.太谷縣鴻昊養(yǎng)殖專業(yè)合作社，山西太谷 030800）

隨著禽類養(yǎng)殖的規(guī)模化、集約化和產(chǎn)業(yè)化的快速發(fā)展，我國每年畜禽糞便的產(chǎn)生量大約有38 億t，其中，肉蛋雞糞便占到16.3%，約有6.2 億t[1-3]。由于畜禽糞污產(chǎn)生集中，而且排放量較大，再加上糞污處理的設施裝備落后，農(nóng)田消納跟不上，這些因素成為制約畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸[4]。雞的腸道較短，消化飼料的能力弱于其他畜種，排出的雞糞一旦暴露到空氣中即易形成NH3等惡臭氣體。為了防治疾病或促進畜禽生長，一些重金屬元素如Cu、Zn、As、Cd 和Pb 等會通過飼料或以伴生礦的形式進入畜禽體內(nèi)，由于這些元素不能完全被吸收且化學性質(zhì)穩(wěn)定，最后隨糞便排出體外[5-6]。此類有害氣體、重金屬和雞糞中存在的病原微生物不僅對環(huán)境造成污染而且危害到人體健康，成為我國主要的農(nóng)業(yè)面源污染[7-8]。雞糞中含有農(nóng)作物生長所必需的氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素和豐富的有機質(zhì)，是很好的有機肥源[9]。如何高效快捷地對雞糞進行無害化處理并得到資源化利用，已成為當今農(nóng)業(yè)領域需要解決的熱點問題。

當前，好氧堆肥技術是實現(xiàn)雞糞減量化、無害化和資源化的有效手段。好氧堆肥可以固化重金屬、抗生素、殺死蟲卵和多種病原微生物，從而獲得穩(wěn)定、安全的堆肥產(chǎn)品，再進一步加工成有機肥施入農(nóng)田，可改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力[10-13]。在實際的生產(chǎn)應用中，雞糞堆肥常出現(xiàn)腐熟不徹底，施入土壤后燒苗和長霉菌現(xiàn)象，有必要對有機肥廠的好氧堆肥過程進行監(jiān)測，以確保堆肥效果。微生物群落的演替是堆肥過程順利進行的反應[14]，利用高通量測序技術研究雞糞堆肥發(fā)酵中微生物群落多樣性，可深入了解好氧發(fā)酵堆肥不同階段的菌群組成結(jié)構(gòu)及其演替過程[15]。

本研究通過對雞糞條垛堆的發(fā)酵過程進行監(jiān)測，研究養(yǎng)殖場條垛式堆肥的腐熟度效果及對重金屬含量的影響，并對堆體內(nèi)微生物的豐度變化進行分析，以期為養(yǎng)殖場有機肥生產(chǎn)初期堆肥產(chǎn)品的腐熟度及安全性提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

雞糞、煙絲和糠醛均由太谷縣鴻昊養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供和購買。堆肥原料的基本理化性質(zhì)如表1所示。

表1 堆肥原料的基本理化性質(zhì)

1.2 試驗設計

試驗在太谷縣鴻昊養(yǎng)殖專業(yè)合作社養(yǎng)殖場的發(fā)酵車間進行。以固液分離后的雞糞為主要原料，煙絲、糠醛為輔料進行條垛式好氧堆肥。堆體大小為長20.0 m、寬1.5 m、高1.35 m，設置2 次堆肥試驗，分別記為堆1 和堆2，在堆制第0、8、18、21、28、33、38、45、60 天堆溫升高欲降低時利用翻拋機翻堆，混合取樣，部分樣品冷藏或自然風干用于腐熟度及其他理化指標測定；部分樣品保存于-20 ℃冰箱用于高通量測序。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 理化指標測定 采用RC-4HC 型便攜式溫濕度記錄儀實時監(jiān)測定堆體內(nèi)40 cm 深度處溫度，每1.5 h 記錄一次；測試樣品物料于105 ℃的烘箱中烘干8 h 至恒質(zhì)量，測定含水率。采用馬弗爐高溫灼燒（600 ℃）4 h 至恒質(zhì)量測定有機質(zhì)含量。利用TOC 儀測定總有機碳，凱氏定氮儀測定總氮。

將新鮮堆肥樣品與蒸餾水按1∶10（m/V）混合于三角瓶中，于水平搖床上振蕩30 min，靜置10 min，上清經(jīng)濾紙過濾后收集，用便攜式pH/電導率儀測定pH 和EC[16-18]。發(fā)芽指數(shù)（GI）的測定方法參照NY/T3442—2019 標準進行。重金屬含量采用原子吸收法測定[10]。

1.3.2 高通量測序 細菌和真菌的基因組DNA 參照OMEGA 試劑盒方法進行提取。細菌PCR 所用測序引物為16S V3～V4 通用引物，正向引物：5′-ACTC CTACGGGAGGCAGCA-3′，反向引物：5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′。真菌PCR 所用引物為ITS V1 引物，正向引物：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAAC AAGG-3′，反向引物：5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3′。PCR 擴增條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，26 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min；12 ℃結(jié)束反應。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果。高通量測序采用Illumina Miseq 測序平臺進行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測序數(shù)據(jù)經(jīng)DADA 2 方法進行去引物，質(zhì)量過濾，去重、去噪，拼接和去嵌合體等，得到特征序列。用QIIME 2 軟件分別在Greengenes 數(shù)據(jù)庫和UNITE數(shù)據(jù)庫對特征序列進行物種分類學注釋，獲得在門、綱、目、科、屬、種6 個分類水平上的物種豐度情況。采用Microsoft Excel 2007 進行基本數(shù)據(jù)整理，用SPSS 20.0 軟件進行方差分析，并采用Duncan 多重比較進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆體溫度的變化

溫度是表征畜禽糞便堆肥能否正常進行的關鍵因素之一。在-14～4 ℃的環(huán)境溫度下，2 種堆體均進行了8 次翻堆。堆1 建堆后溫度開始上升，第4 天達到40 ℃以上，第8 天達到50 ℃以上，經(jīng)過第1 次翻堆后，堆體溫度上升至56.9 ℃，第2 次和第3 次翻堆均在40～50 ℃，在第4 次翻堆后，即第22 天溫度上升至55 ℃以上，到發(fā)酵第60 天堆肥結(jié)束，堆體55 ℃以上溫度持續(xù)時間為37 d。堆2 在第1 天溫度上升至45 ℃，第2 天達50 ℃以上，第3 天即上升至55 ℃，第4 天為59.9 ℃，第1 次翻堆后，堆體溫度在40～50 ℃，第2 次翻堆后溫度很快上升至55 ℃以上，到第4 次翻堆后達到71.2 ℃，除了堆體因翻堆溫度計記錄溫度有所下降外，堆體在55 ℃以上持續(xù)時間第1 次為12 d，第2 次為27 d（圖1）。說明2 種堆體在環(huán)境溫度為白天0～19 ℃、夜間-14～1 ℃的條件下完全能夠達到無害化和穩(wěn)定化的要求。

2.2 不同發(fā)酵階段堆體腐熟度變化

從表2 可以看出，經(jīng)過條垛堆體的晾曬發(fā)酵，堆體含水率下降差異顯著，堆1 和堆2 的含水率在第33 天分別下降至42.12%和41.79%；第60 天后則分別下降至34.00%和39.73%。pH 值呈現(xiàn)顯著性上升趨勢，2 個堆體在第33 天均達到最高值，分別為9.07 和8.77；堆制結(jié)束時，2 個堆體的pH 值分別為8.70 和8.51，堆體由最初的酸性環(huán)境變成堿性環(huán)境。初始堆體的EC 值均較高，堆1 和堆2 的EC 值分別達到9.75、9.26 mS/cm；到第33 天時，2 個堆體的EC 值顯著下降，分別為6.66、5.78 mS/cm；第60 天分別為7.30、6.06 mS/cm，下降了25.13%和34.56%。隨著發(fā)酵時間的延長，堆1 和堆2 的有機質(zhì)含量顯著下降，堆制結(jié)束時分別下降了21.37%和16.83%。雞糞堆肥初始物料的發(fā)芽指數(shù)很低，堆1 和堆2 分別為4.22%和5.06%；到第21 天2 個堆體的發(fā)芽指數(shù)均顯著上升，分別達到44.42%和40.58%；在堆制結(jié)束時，分別達到了86.57%和111.91%。

表2 不同堆肥階段堆料腐熟度分析

2.3 不同階段堆料中重金屬含量變化

對堆1 不同發(fā)酵階段的堆料進行了重金屬檢測，不同種類重金屬的含量差異較大。由表3 可知，堆體中砷（As）、鉛（Pb）和鉻（Cr）的含量較高，分別為1.22～4.92、3.50～12.08、7.53～23.67 mg/kg，汞（Hg）和鎘（Cd）的含量較低，分別為0.02～0.20、0.09～0.13 mg/kg。在第33 天，與初始物料相比，堆料的Cd 含量無顯著差異，As、Pb 和Cr 含量顯著提高，Hg 含量顯著下降。發(fā)酵結(jié)束時，Hg 含量上升，As、Pb 和Cr 含量均下降。熟化后堆肥除Cd 外，其他重金屬含量均顯著提高，As、Hg、Pb 和Cr 含量分別比發(fā)酵結(jié)束時提高了1.02 倍、4.00 倍、1.52 倍和0.93 倍。

表3 不同發(fā)酵階段堆料重金屬含量變化 mg/kg

2.4 雞糞堆肥中微生物菌群表達豐度分析

從圖2 可以看出，雞糞好氧堆肥期間相對表達豐度高于0.01%的真菌門類有6 個，表達豐度較高的4 個門為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、毛霉菌門（Mucoromycota）和油壺菌門（Olpidiomycota）。子囊菌門在整個堆肥階段均維持較高的表達豐度，達80.5%～95.7%，擔子菌門、毛霉菌門和油壺菌門的相對表達豐度分別為0.04%～2.70%、0.03%～2.90%和0～1.90%。球囊菌門（Mortierellomycota）和羅茲菌門（Rozellomycota）僅是在發(fā)酵的初期和末期有較低的表達。在真菌屬水平上，相對表達豐度較高的屬為念珠菌屬（Candida）、畢赤酵母屬（Pichia）、鏈格孢菌屬（Alternaria）、曲霉屬（Aspergillus）、Diutina、干酵母屬（Xeromyces）、Sodiomyces。在建堆初期，念珠菌屬、畢赤酵母屬、曲霉屬豐度較高，堆制8 d 后則念珠菌屬豐度上升；堆制21 d 后，則以鏈格孢菌屬豐度較高；33 d 后，畢赤酵母屬、Diutina 和Xeromyces 較高；第60 天則以子囊菌門的鏈格孢菌屬和Sodiomyces 表達豐度最為豐富，其余菌屬均較初期降低，真菌病原微生物念珠菌屬表達豐度明顯下降，由第8 天的66.9%下降至5.5%。

由圖3 可知，不同階段雞糞堆肥中，相對表達豐度較高的細菌門類為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）。擬桿菌門在第33、60 天中表達豐度較高。建堆初期，厚壁菌門表達豐度達97%，到堆制8 d 后，厚壁菌門為19.4%，放線菌門的豐度顯著升高，達到78.5%；堆置21 d 后厚壁菌門豐度增加（88.8%），放線菌門減少（0.2%），擬桿菌門和變形菌門在堆肥結(jié)束時表達豐度均有增加；在培養(yǎng)第33、60 天后，4 種門類豐度均高于1%。在整個發(fā)酵過程中，厚壁菌門起初豐度最高，發(fā)酵8 d后降低，發(fā)酵21 d 后上升，在第33、60 天時均有較高豐度。擬桿菌門則是在堆肥后期有較高豐度。放線菌門在第8 天豐度急劇上升，在后期豐度保持在較高豐度。變形菌門是在前期較低，后期豐度上升。4 種菌門在后期及有機肥階段均有較高的豐度。在屬水平上，整個發(fā)酵期相對表達豐度較高的屬為棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、梭菌屬（Clostridium）、Caldicoprobacter、依格納季氏菌屬（Ignatzschineria）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、薄壁芽孢桿菌屬（Gracilibacillus）、Sporanaerobacter、食堿菌屬（Alcanivorax）、糞產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）。在建堆初期，以厚壁菌門的梭菌屬和Caldicoprobacter 的豐度較高，堆制8 d 后則以放線菌門的棒狀桿菌屬、厚壁菌門的梭菌屬和芽孢桿菌屬較高；堆制21 d 后，則以變形菌門的依格納季氏菌屬、厚壁菌門的芽孢桿菌屬和Tepidimicrobium 豐度較高；33 d 后，以厚壁菌門的芽孢桿菌屬和薄壁芽孢桿菌屬較高；成品有機肥則以芽孢桿菌屬和薄壁芽孢桿菌屬、變形菌門的食堿菌屬和糞產(chǎn)堿菌屬較高。

3 結(jié)論與討論

新鮮畜禽糞便中含有一些危害作物生長的物質(zhì)，如尿酸、有機酸、氨態(tài)氮、蟲卵、病原菌和重金屬等[19]，因此，畜禽糞便必須經(jīng)過堆肥腐熟后才可用作有機肥，無害化和穩(wěn)定性是雞糞堆肥的主要目標。本研究中堆體55 ℃以上高溫持續(xù)時間均高于15 d，達到了無害化要求。堆料含水率在發(fā)酵結(jié)束時，堆料含水率下降明顯，均小于45%。微生物在雞糞堆肥過程中將蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)降解產(chǎn)生NH4+，引起pH 值的升高，堆體處于一個堿性環(huán)境。本研究中，2 種堆體的pH 起初均呈酸性，隨著堆制時間延長，堆體pH 值上升，到堆制60 d 時，堆體pH 值在8～9[20]，滿足堆肥產(chǎn)品為弱堿性的要求。EC 是評價堆肥產(chǎn)品的重要指標之一[21]。當EC 高于4 mS/cm時，堆肥產(chǎn)品會對植物生長產(chǎn)生抑制作用。雞糞中含鹽量高，經(jīng)過好氧堆肥，盡管堆體的EC 值分別下降了25.13%和34.56%，但對于田間使用來說，本研究中的EC 值均大于4 mS/cm，仍處于一個較高的水平。堆肥原料中的EC 對堆料結(jié)果影響較大，雞糞、煙絲、糠醛的粒徑細小，堆體結(jié)構(gòu)比較致密，導致堆肥產(chǎn)品EC 偏高，這一結(jié)果與張邦喜等[22]的結(jié)果相一致。通過好氧堆肥，堆料的有機質(zhì)含量呈下降趨勢，第60 天時有機質(zhì)含量在60%以上。種子發(fā)芽指數(shù)（GI）也是評價堆肥腐熟程度的重要指標，未腐熟的畜禽糞便施入土壤中，會對農(nóng)田種子發(fā)芽和作物生長有毒害作用，所以，GI 是有機肥利用中首要考慮的因素，當GI 超過80%時，認為堆肥已經(jīng)腐熟或?qū)χ参餂]有毒性[23-24]。雞糞堆肥初始GI 很低，說明未腐熟過的雞糞用于作物種植有很大的風險。本研究中，隨著發(fā)酵的進行，GI 明顯上升，說明堆體中不利于發(fā)芽的因素逐漸被消除，到堆肥60 d 后，GI 達到了80%以上，基本趨于穩(wěn)定。重金屬含量是影響有機肥的品質(zhì)指標之一。鄧雯文等[25]研究表明，As、Cd 和Pb 在發(fā)酵過程中存在先升高后下降的趨勢。本研究中不同階段的發(fā)酵物料其各項重金屬含量也存在波動，腐熟后堆體重金屬含量升高，這應該與好氧堆肥存在濃縮效應有關。YANG 等[26]研究表明，隨之堆肥過程中有機質(zhì)的降解和物質(zhì)的揮發(fā)，物質(zhì)總量不斷減少，重金屬含量相應升高。本研究中堆肥結(jié)束時，5 種重金屬的含量均低于標準限制濃度，說明該雞場雞糞堆肥不存在重金屬超標現(xiàn)象。由以上結(jié)果表明，2 種堆肥均達到畜禽糞便堆肥技術規(guī)范（NY/T 3442—2019）[27]要求。

本研究中雞糞好氧堆肥期間相對表達豐度較高的真菌門類為子囊菌門，這與XIE 等[28]的研究結(jié)果一致。XIE 等[28]研究表明，念珠菌屬、Trichosporon、Kodamaea 和Filabasidium 對人體和動物均有潛在的危害，不同堆肥處理的病原菌念珠菌屬相對豐度隨堆肥過程的進行而降低。本研究中念珠菌屬在發(fā)酵初期表達豐度較高，到后3 次翻堆時，念珠菌屬的表達大幅下降，由66.9%下降至5.5%。曲霉屬、Malbranchea 和Mycothermus 在堆肥成熟階段表達豐度較高，它們在高溫好氧堆肥中可以降解纖維素和半纖維素[28]。本研究中，鏈格孢菌屬、曲霉屬在堆肥期間均有較高豐度，應該與降解大分子有機化合物有關。雞糞堆肥的優(yōu)勢細菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門，這與ZHONG 等[29]的結(jié)果一致。本研究中成品有機肥的芽孢桿菌屬和薄壁芽孢桿菌屬、變形菌門的Alcanivorax 和糞產(chǎn)堿菌屬較高。雞糞中的主要細菌病原菌為大腸桿菌和沙門氏菌，它們分別屬于變形菌門的埃希氏菌屬和沙門氏菌屬，在本研究中未檢測到大腸桿菌和沙門氏菌。從真菌和細菌表達豐度的結(jié)果表明，雞糞堆肥減少了部分病原菌的豐度。由于對畜禽糞污病原菌信息掌握不夠，對于與病原菌相關的微生物種類及其表達豐度還有待進一步分析。