張偉

開封市兒童醫(yī)院，河南 開封 475000

馬齒莧，又名長壽菜，為常見的藥食同源的中藥，來源廣，應用廣泛，內(nèi)服用于治療痢疾，有降糖、降脂等作用［1］，外用可以治療濕疹、扁平疣和尖銳濕疣等［2－3］。其性寒味酸，入大腸、肝、脾經(jīng)，有清熱解毒、消癰利尿之功效，適用于濕熱或熱毒所致的痢疾、癰腫和淋癥等［4］。有研究表明，其性寒滑利，清血分及大腸熱毒，為中醫(yī)臨床治痢疾的常用品，有“痢疾克星”之稱［5］?！侗静菥V目》記載“散血消腫，利腸滑胎，解毒通淋，治產(chǎn)后虛汗”。中藥因其成分復雜，靶點眾多，應用網(wǎng)絡藥理學研究中藥藥理作用的分子作用機制有重要意義。

本研究通過收集整理馬齒莧的主要成分和作用靶點，構(gòu)建成分靶點網(wǎng)絡，采用網(wǎng)絡藥理學的方法分析馬齒莧藥理作用的分子機制，為尋找馬齒莧潛在的藥理作用提供了依據(jù)。

1 方法

1.1 活性成分及靶標蛋白的篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology data base and analysis platform，TCMSP）［6］（http：／／tcmspw.com／tcmsp.php）檢索“馬齒莧”。口服生物利用度（oral availability，OB），即口服后藥物以原型形式進入血液循環(huán)的相對量，是確定藥物生物活性，可作為藥物的關(guān)鍵指標，篩選值≥30%。類似性（drug－likeness，DL）是基于相似性原理，總體相似的分子應具有相似的生物活性；DL≥0.18，即“類藥物”化合物的選擇標準。根據(jù)活性成分在相關(guān)靶點中選出相應的靶點蛋白名稱。

1.2 靶蛋白的基因symbol確定及成分－靶基因網(wǎng)絡的構(gòu)建通過UNIPROT［7］數(shù)據(jù)庫（https：／／www.uniprot.org／）和GENECARDS［8］（https：／／www.genecards.org／）數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白轉(zhuǎn)化為相應的gene symbol，采用Cytoscope3.6.0軟件構(gòu)建成分－靶基因網(wǎng)絡圖。

1.3 構(gòu)建蛋白相互作用（protein－protein interation，PPI）網(wǎng)絡應用STRING［9］（https：／／stringdb.org／）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建相關(guān)靶蛋白的PPI網(wǎng)絡，并根據(jù)度值篩選核心網(wǎng)絡作用圖。

1.4 靶蛋白的富集分析采用在線富集分析網(wǎng)站Metascape［10］（https：／／metascape.org／gp／index.html）對靶點蛋白進行GO富集分析和KEGG通路富集。

1.5 實驗流程圖見圖1。

圖1 實驗流程圖

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選結(jié)果從馬齒莧中共篩選出10種（占54種化合物的18.52%）具有良好的口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）的化合物。見表1。

表1 馬齒莧活性化合物篩選結(jié)果

2.2 化合物－靶點相互作用網(wǎng)絡共篩選出靶點221個蛋白基因?；衔铮械鞍谆蛳嗷プ饔镁W(wǎng)絡圖，見圖2。

圖2 馬齡莧有效成分－靶點作用網(wǎng)絡圖

2.3 靶基因相互作用網(wǎng)絡（PPI分析）及高連接子圖篩選將所有靶基因數(shù)據(jù)導入STRING數(shù)據(jù)庫中進行PPI分析，PPI網(wǎng)絡圖共212個節(jié)點，3 898條邊，網(wǎng)絡異構(gòu)度為0.808，聚集系數(shù)為0.585，PPI富集P＜0.001，蛋白相互作用包括共表達、共現(xiàn)、融合、調(diào)控和注釋途徑等相互作用［11］。度值前10位節(jié)點的拓撲學參數(shù)，見表2。蛋白質(zhì)網(wǎng)絡中節(jié)點度值越大，表明該蛋白質(zhì)參與的相互作用越多，體現(xiàn)了該蛋白質(zhì)與周圍蛋白質(zhì)之間的直接聯(lián)系的能力更強，對于蛋白質(zhì)網(wǎng)絡的影響力就越大，該蛋白質(zhì)是關(guān)鍵蛋白質(zhì)的可能性越大［12］。度值最高的AKT1是絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶之一，調(diào)節(jié)多種過程，包括代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成［13－15］。ALB為血漿白蛋白，在調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓中起到重要作用，并充當多種內(nèi)源性分子及外源性藥物的載體蛋白［16］。白細胞介素－6（interleukin－6，IL－6）參與炎癥反應，在急性期參與B細胞活化［17］。TP53、TNF、VEGFA、CASP3、JUN、MAPK8均參與腫瘤的生成和壞死［18－23］。見圖3。

表2 度值前10位蛋白的拓撲學參數(shù)

圖3 PPI作用網(wǎng)絡及核心網(wǎng)絡篩選圖

2.4 靶蛋白基因GO富集分析和KEGG富集分析GO富集分析和KEGG通絡富集均在Metascape（https：／／metascape.org／gp／index.html）上完成，GO富集分析包括生物過程（biological progress，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞成分（cellular component，CC）。選取顯著性前20位富集結(jié)果做氣泡圖，圖4為BP富集結(jié)果，圖5為MF富集結(jié)果，圖6為CC富集結(jié)果，圖7為KEGG通路富集結(jié)果。MF富集分析顯示了作用靶點多具有與配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、核受體激活、類固醇激素受體激活、銨離子結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體激活等分子功能，BP富集分析主要包括對有機環(huán)狀化合物反應過程、對有毒物質(zhì)反應過程、對無機物的反應過程等；CC富集分析顯示這些靶點蛋白主要分布在突觸后膜、細胞質(zhì)核周區(qū)域、細胞外基質(zhì)等；主要的通路包括癌癥通路、乙型肝炎通路、動脈粥樣硬化通路等。說明馬齒莧作用范圍廣泛，通過多種途徑調(diào)節(jié)機體功能，包括腫瘤形成、乙型肝炎、動脈粥樣硬化等。

圖4 BP富集分析氣泡圖

圖5 MF富集分析氣泡圖

圖6 CC富集分析氣泡圖

圖7 KEGG富集分析氣泡圖

顏色由綠到紅為－log10（fdr）范圍從小到大，－lg（fdr）越大說明顯著性越強，fdr為調(diào)整后P值，即q值），氣泡大小為富集的基因數(shù)目，縱坐標為各個富集的名稱，橫坐標為富集倍數(shù)。

3 討論

本研究通過對馬齒莧的有效成分進行篩選，尋找靶點蛋白，轉(zhuǎn)換成靶點基因，靶基因相互作用和富集分析來研究馬齒莧藥理作用的分子機制。符合多靶點、多通路和多種分子機制共同作用的條件。有效成分的篩選僅僅從口服生物利用度和參數(shù)方面考慮，沒有考慮有效成分在馬齒莧中的含量濃度，可能會存在一定的誤差。

蛋白質(zhì)不能獨立執(zhí)行生物功能，而是通過相互作用以協(xié)作的方式完成生物功能，PPI在生命活動中起到核心作用。PPI是互相作用的蛋白質(zhì)在物理上的接觸，形成蛋白質(zhì)復合物或短暫接觸后又發(fā)生了分離［24］。通過PPI網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)馬齒莧作用的主要蛋白AKT1參與炎癥、癌癥、糖尿病及心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展。研究表明，AKT信號通路在心肌肥厚和重塑中起著重要作用［25］。馬齒莧前10的作用靶點分子中除了AKT1，IL－6、TNF也是炎癥反應中重要的細胞因子。IL－6是細胞因子網(wǎng)絡中重要成員，在急性炎癥反應中處于中心地位，可誘導產(chǎn)生C反應蛋白和降鈣素原生成，與炎性疾病及感染程度直接相關(guān)［26］。研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧可以抑制IL－6表達，抑制潰瘍性結(jié)腸炎的癌變［27］。前10作用分子中其他靶點參與腫瘤發(fā)展、細胞分裂等。研究表明，馬齒莧中提取的多糖能提高小鼠的免疫功能，同時也可直接抑制腫瘤細胞分裂［28］。有實驗發(fā)現(xiàn)，馬齒莧通過驅(qū)邪扶正作用起到抗病毒作用［29］。富集分析結(jié)果顯示了馬齒莧的靶蛋白多參與細胞分裂、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物過程。這些研究結(jié)果均與基因富集分析結(jié)果中靶基因蛋白所參與的多條癌癥通路及心血管疾病通路相對應。有研究表明，馬齒莧提取液具有抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌等作用［30］，本研究重點關(guān)注于馬齒莧在人體中潛在存在的靶點蛋白的作用，其他生物的靶點蛋白不在考慮范圍內(nèi)。

本研究僅分析了馬齒莧的作用分子機制，沒有把相關(guān)疾病靶點映射到其作用靶點中，探討馬齒莧與某種疾病的關(guān)系。后續(xù)研究要注意把相關(guān)疾病與馬齒莧作用靶點相互映射，為中藥治療相關(guān)疾病的開發(fā)提供依據(jù)。