郝建梅，毛明華，呂生霞，陳香妮，袁超，石磊，楊震

西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710021

肝纖維化是肝臟的常見疾病之一，慢性肝炎發(fā)展為肝硬化的過程中常常伴隨有肝纖維化［1－3］。在慢性肝臟損傷過程中，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）分泌增加和（或）降解減少，ECM大量沉積可能會導致肝纖維化［4－5］。桃紅化濁丸臨證60余年，是治療濕熱傷肝病證的經(jīng)驗方［6－8］。前期臨床研究表明，其抗肝纖維化療效顯著，已形成院內(nèi)制劑，長期臨床醫(yī)療實踐表明，該藥療效確切，且未見明顯不良反應發(fā)生，是治療肝纖維化的有效方藥。為探究其作用機制，課題組將探討其與Smad3、金屬蛋白酶組織抑制因子－1（the tissue inhibitor of metalloproteinases－1，TIMP－1）蛋白及其基因和miRNA29b的關系，從而揭示桃紅化濁丸對肝纖維化的作用機理，形成清熱化濕、疏肝健脾、活血通絡法治療本病的診治規(guī)范，為以后的新藥研發(fā)奠定基礎。

1 材料

1.1 動物健康SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，購自西安交通大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（陜）2019－003，倫理號：2019－1358，體質量180～220 g，飼養(yǎng)溫度：（22±1）℃，濕度：50%～70%，換氣次數(shù)：15～20次·h－1，氣流速度：0.1～0.2 m·s－1，光照：150～200 Lx，12 h明暗交替，自由攝取水和食物。

1.2 藥材及試劑桃紅化濁丸由西安市中醫(yī)醫(yī)院提供；RNAiso Plus（上海善然生物科技有限公司，批號：9108）；RNA逆轉錄試劑盒（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司，批號：8BC01）；StarScriptⅡcDNA第一鏈合成試劑盒－Ⅱ（北京康潤誠業(yè)生物科技公司，貨號：A214－10）；預混實時熒光定量快速PCR反應體系（北京康潤誠業(yè)生物科技公司，貨號：A301－05）；RIPA裂解液（西安赫特生物技術有限公司，WB053）；Smad3、TIMP－1抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，貨號分別為：66516－1－Ig、16644－1－AP；β－肌動蛋白（β－actin）單克隆抗體（美國CST公司，貨號：3700）。

1.3 儀器F6／10型手持式高速離心機（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；PowerPacTM型電泳儀電源（美國Bio－Rad公司）；Trans－blot型轉印槽（美國Bio－Rad公司），CFX ConnectTM型PCR儀（美國Bio－Rad公司）；5424R型冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Genegnome XRQ型專業(yè)化學發(fā)光成像系統(tǒng)（中國基因有限公司）；DS－11型超微量分光光度計（中國倍輝科技有限公司）。

2 方法

2.1 動物模型的復制與分組40只大鼠，隨機選10只為空白組，其余大鼠采用腹腔注射體積分數(shù)為40%的CCl4復制大鼠肝纖維化模型［9］，一周注射2次，連續(xù)2周。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、秋水 仙 堿（0.5 mg·kg－1）組、桃 紅 化 濁 丸（1.54 g·kg－1）組，每組10只大鼠，在模型成功1周后，給予相應的藥物進行灌胃，連續(xù)給藥6周。

2.2 Western Blot檢測大鼠肝臟Smad3、TIMP－1蛋白表達每組隨機選擇5只大鼠，用戊巴比妥鈉麻醉后，取大鼠的肝臟，稱重后加入蛋白裂解液勻漿，離心后取上清液，測定蛋白濃度后，變性。電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影。參照蛋白為β－actin［10－11］。

2.3 RT－PCR法檢測大鼠肝臟miRNA29b、Smad3mRNA和TIMP－1mRNA表達每組隨機選擇5只大鼠，用戊巴比妥鈉麻醉后，取大鼠的肝臟，稱重后加入RNAiso Plus提取總RNA。逆轉錄時加入1μg的RNA樣品、Primer Script RT Master Mix和無RNase水至10μL，輕輕搖動使其均勻混合，然后進行逆轉錄反應，反應后采用兩步法進行PCR反應，反應條件：預變性在95℃下反應2 min，變性在95℃下反應15 s，退火／延伸在60℃下反應30 s，共40個循環(huán)［12－14］。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。以平均數(shù)±標準誤（±s）用于表示數(shù)據(jù)結果，單因素方差分析及t檢驗用于組間進行比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 桃紅化濁丸對大鼠肝臟Smad3、TIMP－1蛋白表達的影響與空白組比較，模型組大鼠肝臟Smad3、TIMP－1蛋白表達明顯上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，桃紅化濁丸組Smad3、TIMP－1蛋白表達下調(diào)（P＜0.01）。見圖1、圖2。

圖1 大鼠肝組織中Smad3、TIMP－1蛋白表達

圖2 大鼠肝組織中Smad3、TIMP－1蛋白表達

3.2 桃紅化濁丸對大鼠肝組織中Smad3、TIMP－1mRNA和miRNA29b表達的影響與空白組比較，模型組大鼠肝組織miRNA29b水平明顯降低（P＜0.05），Smad3mRNA、TIMP－1mRNA水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，桃紅化濁丸組和秋水仙堿組大鼠肝組織miRNA29b水平明顯升高（P＜0.05），Smad3mRNA、TIMP－1mRNA水平明顯降低（P＜0.05），見表2。

表2 桃紅化濁丸對大鼠肝組織中Smad3、TIMP－1 mRNA和miRNA29b表達的影響 （±s）

表2 桃紅化濁丸對大鼠肝組織中Smad3、TIMP－1 mRNA和miRNA29b表達的影響 （±s）

注：與空白組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別 n miRNA29b Smad3 mRNA TIMP－1 mRNA空白組 5 1.0024±0.0846 1.0124±0.186 1 1.0029±0.0930模型組 5 0.283 7±0.034 6＃2.073 3±0.224 7＃1.627 6±0.273 2＃秋水仙堿組 5 0.467 7±0.039 5*1.473 1±0.107 5*1.241 7±0.089 9*桃紅化濁丸租 5 0.508 6±0.094 7*1.623 2±0.302 3*1.257 4±0.123 1*

4 討論

肝纖維化多屬于中醫(yī)學“脅痛”“積聚”“肝痹”等范疇，對肝纖維化的病因病機認識，大多數(shù)醫(yī)家均認同其發(fā)病為濕熱疫（蟲）毒之邪侵擾機體，機體正氣不足、正不敵邪、邪氣踞之而損傷機體，導致氣血痰瘀交雜，臟腑氣血陰陽失調(diào)。濕毒、痰濁、瘀血與正氣虧損貫穿肝纖維化發(fā)展全過程［15］。檢索國內(nèi)外有關中醫(yī)藥診療乙型肝炎肝硬化文獻發(fā)現(xiàn)，對乙型肝炎肝硬化證候分布進行統(tǒng)計，（不含兼夾證）濕熱內(nèi)蘊排在首位［16］，可見濕熱在肝纖維化中的作用。

本課題組楊震教授在臨床肝病的辨治中創(chuàng)新性應用朱丹溪“相火論”的觀點，把肝病所產(chǎn)生的局部內(nèi)生火熱按病理相火這一理論去研究，提高了對肝病病機的認識。根據(jù)自己治療肝病的體會，對肝病臨床診治，按疾病的發(fā)展過程將病理性相火分為六型：郁熱相火、血熱相火、濕熱相火、瘀熱相火、陰虛相火、相火虛衰。認為肝病遷延反復，加之肝病必然乘脾，脾失健運則易出現(xiàn)肝郁夾濕、郁久化熱，而形成濕熱相火之證。病機特點為肝郁乘脾、濕滯化熱。濕熱是病因，肝臟是病位，調(diào)治時應緊緊抓住肝郁與濕滯這一對主要矛盾，疏肝時應注意不要耗氣傷陰，化濕時不要寒涼滯脾。臨床對肝病中的濕熱相火，強調(diào)治法不宜用丹溪的苦寒泄火法，而應用溫病學家治濕的理論，來指導濕熱傷肝的證治，利濕而不傷陰、清熱而不助濕，宜用芳香化濁、辛開苦降之法。臨床自擬“桃紅化濁湯”，方中用藿香、佩蘭葉、香薷芳香化濁以醒脾困，青皮、郁金理氣疏肝以解肝郁，薏仁、茯苓健脾化濕以健脾運，茵陳、白茅根、板藍根清熱利濕以清相火，桃仁、紅花疏通肝絡以防瘀結，兼作引經(jīng)以清血分濕熱。

全方疏肝健脾、清熱利濕、活血通絡，標本兼顧，從根本上糾正虛實偏頗［17］。桃紅化濁丸用于中醫(yī)證屬濕熱瘀阻型的肝纖維化患者，臨床療效顯著［18］。本課題采用桃紅化濁丸治療肝纖維化，并通過現(xiàn)代科學技術揭示其治療肝纖維化的機理，為肝纖維化患者提供一種效優(yōu)價廉的治療用藥。

miRNA是一種單鏈RNA，它能調(diào)節(jié)機體多種生物過程［19］。研究表明，miRNA29b能負向調(diào)節(jié)纖維化蛋白，抑制機體纖維化［20－21］。Smad3是轉化生長因子β1（TGF－β1）的下游因子，TGF－β1是一種纖維化因子，可以激活Smad3導致肝纖維化的發(fā)生［22－23］，TGF－β1／Smad3信號通路在肝纖維化進程中起到重要作用。肝纖維化的主要特點是細胞外基質ECM的集聚，ECM的降解需要蛋白酶水解，TIMP－1與肝纖維化密切相關［24］，許多研究都表明中藥通過調(diào)節(jié)TIMP－1水平來治療肝纖維化［25－27］。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，桃紅化濁丸組能明顯下調(diào)大鼠肝臟Smad3、TIMP－1蛋白表達，升高miRNA29b水平，降低Smad3mRNA、TIMP－1mRNA水平。明確了桃紅化濁丸可能通過影響miRNA29b表達，從而降低Smad3、TIMP－1蛋白和基因的含量，可能是其防治肝纖維化的機制及生物學效應，為后期科學闡釋桃紅化濁丸的作用機制提供了依據(jù)。