賴慧超 肖婷婷 劉劍英 黃雪梅 徐敏娟

（贛州市人民醫(yī)院婦科，贛州341000）

上皮性卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿且進(jìn)展迅速，惡性程度相對(duì)于其他婦科腫瘤較高[1］。目前臨床多采用放化療及手術(shù)等手段進(jìn)行上皮性卵巢癌治療，但由于患者就診時(shí)已處于晚期、腫瘤細(xì)胞耐藥發(fā)生等原因，患者5年生存率仍處于較低水平[2］。尋找新的相關(guān)腫瘤生物標(biāo)志物對(duì)準(zhǔn)確評(píng)估上皮性卵巢癌患者病情進(jìn)展及患者預(yù)后有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一種穩(wěn)定存在于機(jī)體內(nèi)的調(diào)控因子，在腫瘤進(jìn)展中與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等密切相關(guān)。研究表明，LncRNA H19在宮頸癌組織中高表達(dá)，可能作為宮頸癌診斷的生物標(biāo)志物[3］。乳腺癌患者血清中LncRNA H19表達(dá)水平也明顯升高，與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控密切相關(guān)[4］。此外，已有研究證實(shí)LncRNA P21是腫瘤進(jìn)展中的抑制因子，可用作腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控[5］。有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中LncRNA H19水平上調(diào)，可與p53發(fā)生拮抗并靶向促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[6］。而p53也被證實(shí)在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中可靶向上調(diào)LncRNA P21表達(dá)發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用[7］。表明腫瘤進(jìn)展中LncRNA H19與LncRNA P21表達(dá)可能存在一定相關(guān)性。另由于LncRNA H19與LncRNA P21在上皮性卵巢癌中研究較少，作用機(jī)制尚不明確，本研究通過檢測(cè)上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19、P21表達(dá)水平，分析二者間相關(guān)性及與患者預(yù)后關(guān)系，初步探討其在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2016年7月至2020年7月本院收治的上皮性卵巢癌患者50例作為研究對(duì)象（上皮性卵巢癌組），患者年齡29～76歲，平均（53.08±10.32）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)（International federation of gynecology and obstet‐rics，F(xiàn)IGO）分期標(biāo)準(zhǔn)[8］、世界衛(wèi)生組織（World health organization，WHO）分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[9］，經(jīng)病理切片證實(shí)為上皮性卵巢癌；②均需進(jìn)行手術(shù)治療；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并患有其他部位惡性腫瘤患者；②心、腎、肝臟等功能嚴(yán)重不足者；③患有嚴(yán)重精神疾病者；④使用過藥物治療或放療及化療者。另選取同期在本院進(jìn)行手術(shù)治療的上皮性卵巢良性腫瘤患者50例作為良性腫瘤組，包括漿液性囊腺瘤34例、黏液性囊腺瘤16例。良性腫瘤組患者年齡28～74歲，平均（52.84±10.18）歲。上皮性卵巢癌組與良性腫瘤組患者年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。另選擇于本院進(jìn)行健康體檢的正常女性50例為對(duì)照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。1.1.2主要儀器與試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（型號(hào)：7500）購(gòu)自美國(guó)ABI公司；RNA提取試劑盒（貨號(hào)：775001）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：866001）、qRT-PCR試劑盒（貨號(hào)：3914001）購(gòu)自美國(guó)Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有研究對(duì)象均于入院時(shí)抽取空腹靜脈血10 ml，室溫以3000 r/min離心10 min獲取血漿樣本，并在?80℃冰箱保存待檢。

1.2.2 血漿LncRNA H19、LncRNA P21表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR法檢測(cè)血漿LncRNA H19、Lnc-RNA P21表達(dá)水平。使用試劑盒進(jìn)行RNA提取及RNA反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA在相應(yīng)反應(yīng)體系下進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。20 μl反應(yīng)體系如下：SYBR?Primix Ex TaqTM10 μl，ROX 0.4 μl，cDNA 2 μl，上、下游引物各2 μl，無 酶水3.6 μl。反應(yīng) 步驟 如下：95℃8 min，1個(gè)循環(huán)；95℃15 s，62℃38 s，73℃15 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。實(shí)驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參基因，LncRNA H19上游引物：5'-TGATGACGGGTG‐GAGGGGCTA-3'，下 游 引 物：5'-TGATGTCGCCCT‐GTCTGCACG-3'；LncRNA P21上游引物：5'-GGGTG‐GCTCACTCTTCTGGC-3'，下游引物：5'-TGGCCTT‐GCCCGGGCTTGTC-3'；GAPDH上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。采用2???Ct法計(jì)算血漿Lnc-RNA H19、LncRNA P21相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用[n（%）］表示，行χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較行t檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，總體有差異再行SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。采用Pearson法分析上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達(dá)水平相關(guān)性；采用Logistic回歸模型進(jìn)行危險(xiǎn)因素分析，采用向后剔除法，行LR檢驗(yàn)；采用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線分析血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達(dá)水平對(duì)上皮性卵巢癌發(fā)生的診斷價(jià)值。P<0.05表示數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19、Lnc-RNA P21表達(dá)水平與患者臨床病理特征關(guān)系 不同年齡、腫瘤直徑、病理類型、病理分級(jí)及是否更年期患者上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19、Lnc-RNA P21表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血漿LncRNA H19表達(dá)水平高于Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，血漿LncRNA P21表達(dá)水平低于Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05），見表2。

表2 上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19、LncRNA P21表達(dá)水平Tab.2 Plasma LncRNA H19 and LncRNA P21 expression levels in patients with epithelial ovarian cancer

2 結(jié)果

2.1 三組血漿LncRNA H19、LncRNA P21表達(dá)水平比較 如表1所示，上皮性卵巢癌組血漿LncRNA H19表達(dá)水平明顯高于上皮性卵巢良性腫瘤組和對(duì)照組（P<0.05），血漿LncRNA P21表達(dá)水平明顯低于上皮性卵巢良性腫瘤組和對(duì)照組（P<0.05）。

表1 3組血漿LncRNA H19、P21表達(dá)水平比較（±s）Tab.1 Comparison of plasma LncRNA H19 and P21 expression levels in 3 groups（±s）

表1 3組血漿LncRNA H19、P21表達(dá)水平比較（±s）Tab.1 Comparison of plasma LncRNA H19 and P21 expression levels in 3 groups（±s）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with benign tumor group，2）P<0.05.

Groups Epithelial ovarian cancer Benign tumor Control F P n 505050? ?LncRNA H192.95±0.721）2）1.18±0.301.01±0.28252.0890.000 LncRNA P210.46±0.181）2）0.94±0.291.03±0.3166.2510.000

2.3 上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19與Ln‐cRNA P21表達(dá)水平相關(guān)性 如圖1所示，上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=?0.429，P=0.000）。

圖1 上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達(dá)水平相關(guān)性Fig.1 Correlation between plasma LncRNA H19 and Lnc-RNA P21 in patients with epithelial ovarian cancer

2.4 上皮性卵巢癌發(fā)生的影響因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Lnc-RNA H19高表達(dá)、LncRNA P21低表達(dá)是影響上皮性卵巢癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素（P<0.05）。多因素分析結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Lnc-RNA H19高表達(dá)、LncRNA P21低表達(dá)是影響上皮性卵巢癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05），見表3、4。

表3 影響上皮性卵巢癌發(fā)生的單因素Logistic回歸分析Tab.3 Univariate Logistic regression analysis of epithelial ovarian cancer

表4 影響上皮性卵巢癌發(fā)生的多因素Logistic回歸分析Tab.4 Multivariate Logistic regression analysis of influencing factors on occurrence of epithelial ovarian cancer

2.5 血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達(dá)水平對(duì)上皮性卵巢癌發(fā)生的診斷價(jià)值分析 如圖2和表5所示，血漿LncRNA H19、LncRNA P21表達(dá)水平聯(lián)合對(duì)上皮性卵巢癌發(fā)生診斷的曲線下面積為0.892，均明顯高于二者單獨(dú)對(duì)上皮性卵巢癌發(fā)生診斷的曲線下面積（0.804、0.797，Z=2.134、2.122，P=0.033、0.034）。

圖2 血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達(dá)水平對(duì)上皮性卵巢癌發(fā)生的診斷價(jià)值Fig.2 Diagnostic value of plasma LncRNA H19 and Lnc-RNA P21 expression levels in epithelial ovarian cancer

表5 血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達(dá)水平對(duì)上皮性卵巢癌發(fā)生的診斷價(jià)值分析Tab.5 Diagnostic value of plasma LncRNA H19 and Lnc-RNA P21 expression levels in epithelial ovarian cancer

3 討論

卵巢癌作為婦科三大惡性腫瘤之一，仍是威脅女性生命健康的主要惡性疾病，其中上皮性卵巢癌約占全部卵巢癌的85%以上[10］。目前上皮性卵巢癌進(jìn)展的病理機(jī)制尚未完全明確，在分子水平上探究其發(fā)生發(fā)展影響因素是提高患者生存率、探尋治療靶點(diǎn)的重要手段。

LncRNA是一類長(zhǎng)度大于200 nt的RNA分子，不具有編碼蛋白質(zhì)潛能，但可參與機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖凋亡等多種生物學(xué)進(jìn)程調(diào)控，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。LncRNA H19位于人類染色體11p15.5，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的印記基因，已被證實(shí)對(duì)腫瘤發(fā)生具有抑制和促進(jìn)雙重作用[11］。研究表明，前列腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)LncRNA H19可靶向miR‐NA抑制癌細(xì)胞遷移[12］。此外有研究發(fā)現(xiàn)，體外過表達(dá)LncRNA H19可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥，并可通過調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進(jìn)癌細(xì)胞增殖遷移[13］。本研究結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌組血漿LncRNA H19表達(dá)水平明顯高于上皮性卵巢良性腫瘤組和對(duì)照組，與WU等[13］的研究結(jié)果相似，提示血漿LncRNA H19表達(dá)水平升高可能與上皮性卵巢癌發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血漿LncRNA H19表達(dá)水平高于Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，提示LncRNA H19可能通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、遷移促進(jìn)上皮性卵巢癌發(fā)展。而已有研究表明LncRNA H19在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，與靶向p53調(diào)控癌細(xì)胞增殖有關(guān)[14］，推測(cè)本研究中LncRNA H19可能靶向調(diào)控p53基因水平影響上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖等。

LncRNA P21位于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1（cyclin-dependent kinase inhibitor 1，P21）上游約15 kb處，與細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控密切相關(guān)。P21被證實(shí)在膀胱癌、肺癌、結(jié)直腸癌中表達(dá)水平降低，與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等受到抑制有關(guān)[15-17］。本研究結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌組血漿LncRNA P21表達(dá)水平明顯低于上皮性卵巢良性腫瘤組和對(duì)照組，且Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血漿LncRNA P21表達(dá)水平較Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者低，與前人在其他腫瘤中研究結(jié)果相似[15-17］，提示LncRNA P21表達(dá)水平下調(diào)可能與上皮性卵巢癌的發(fā)生有關(guān)，其水平持續(xù)降低可能預(yù)示患者病情進(jìn)一步發(fā)展?？赡苷{(diào)控機(jī)制為，LncRNA P21水平下調(diào)時(shí)其與STAT3等結(jié)合減少，進(jìn)而導(dǎo)致其對(duì)細(xì)胞周期G1期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力減弱，最終促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[7］。有研究證實(shí)，LncRNA P21是抑癌基因P53的下游調(diào)控因子，推測(cè)LncRNA P21在上皮性卵巢癌中表達(dá)降低可能與p53合成受抑制有關(guān)，該機(jī)制最終可能通過影響腫瘤上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制卵巢腫瘤生長(zhǎng)[18］。

由于LncRNA H19、P21表達(dá)均與p53基因表達(dá)關(guān)系密切[12］，本研究經(jīng)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19與LncRNA P21表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中Ln‐cRNA H19、LncRNA P21間可能存在共同的調(diào)控通路，以發(fā)揮其調(diào)控癌細(xì)胞增殖遷移作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血漿LncRNA H19高表達(dá)、血漿LncRNA P21低表達(dá)是影響上皮性卵巢癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，且二者聯(lián)合對(duì)上皮性卵巢癌的診斷效能較高，提示血漿LncRNA H19、P21表達(dá)水平與上皮性卵巢癌進(jìn)展密切相關(guān)，可能用于評(píng)估上皮性卵巢癌發(fā)生。

綜上所述，上皮性卵巢癌患者血漿LncRNA H19呈高表達(dá)、血漿LncRNA P21呈低表達(dá)，均與腫瘤FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，二者聯(lián)合對(duì)上皮性卵巢癌發(fā)生的診斷價(jià)值較高。但由于本研究?jī)H從表達(dá)水平層面分析二者間相關(guān)性，具體的作用機(jī)制及診斷價(jià)值尚需進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。