劉 帆 何 琴 王鴻利 黃 丹 楊文娟

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院草堂病區(qū)老年內(nèi)五科，成都610072）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知和行為衰退，最終導(dǎo)致死亡[1］。目前研究表明，AD 病理特點(diǎn)為胞外amyloid-β（Aβ）肽聚合，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)和Tau 蛋白高度磷酸化[2］。Aβ 肽可以多種形式存在，如單體、低聚物或纖維狀。越來越多證據(jù)表明，AD 發(fā)病機(jī)制為低聚物形式的Aβ 肽在胞外聚集[3-4］。目前AD 治療藥物主要為乙酰膽堿酯酶抑制劑（acetylcholinesterase inhibitors，AChEIs）和n-甲基-d-天冬氨酸受體拮抗劑（N-methyl-D-aspartate，NMDA），但無法達(dá)到預(yù)期治療效果，且存在危及生命的潛在副作用[5-6］。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑特點(diǎn)，在AD 治療方面優(yōu)于單靶點(diǎn)藥物[7-8］。綠原酸具有多種生物效應(yīng)，包括抗菌、抗氧化、抗炎、抗癌、抗糖尿病、抗高血壓、抗肥胖等作用[9-11］。已有研究表明，綠原酸發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制是通過抑制乙酰膽堿和丁酰膽堿活性，從而減緩腦內(nèi)乙酰膽堿和丁酰膽堿破壞，防止氧化性神經(jīng)退行性變[12］。因此，本文主要研究綠原酸對(duì)Aβ 誘導(dǎo)的AD神經(jīng)損傷及NLRP3炎癥小體活化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性昆明小鼠（5～6 周齡）購于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào)：SCXK（川）2018-110。 22℃、50%相對(duì)濕度，12 h光/12 h暗循環(huán)飼養(yǎng)，自由飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 5-HT、5-HIAA、iNOS、IL-6和TNF-α 試劑盒購自南京建成生物研究所；BCA 試劑盒購自合肥萊爾生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自Promega 公司；所有抗體均購自上海艾博抗生物科技有限公司；綠原酸購自成都曼斯特生物有限公司；BX43 光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯；酶標(biāo)儀（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。

1.2 方法

1.2.1 AD 小鼠模型建立及治療 參考文獻(xiàn)[13］制備低聚Aβ1-42溶液，PBS 溶解，使用前37℃孵化72 h。小鼠腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和二甲苯（20 mg/kg）進(jìn)行麻醉。孵化72 h 后，采用1 L 漢密爾頓注射器將Aβ1-42注射于小鼠雙側(cè)大腦海馬體（1.0 L，0.1 L/min）構(gòu)建AD 小鼠模型[14］。AD 小鼠隨機(jī)分為5 組：對(duì)照組、模型組、綠原酸低、中、高劑量治療組（20、50、100 mg/kg）[15］。模型建立第15 天口服給予小鼠綠原酸，連續(xù)21 d，對(duì)照組口服等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。

1.2.2 神經(jīng)損傷評(píng)分 各組小鼠建模15 d 后進(jìn)行神經(jīng)損傷評(píng)分，具體參考Longa 神經(jīng)評(píng)分法[16］。0 分：正常，無神經(jīng)損傷；1 分：左側(cè)前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)損傷；2 分：行走時(shí)，小鼠向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3 分：行走時(shí)，小鼠身體向癱瘓側(cè)傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4 分：不能自發(fā)行走，有意識(shí)喪失[16］。

1.2.3 腦含水量檢測(cè) 采用干濕重法測(cè)定小鼠腦組織含水量：取小鼠腦組織約100 mg，稱重（濕重），110℃烘烤腦組織24 h 以上至恒重，稱重（干重）。腦組織含水量（%）=（濕重?干重）/濕重×100%[17］。

1.2.4 HE 染色 處死小鼠，分離腦組織，石蠟包埋，連續(xù)切片（4 μm），HE 染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察小鼠海馬體。

1.2.5 Western blot 腦組織加入液氮研磨，裂解緩沖液裂解，4℃、14000 r/min 離心15 min，形成濃縮蛋白。取20 μg 總蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，37℃下5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入抗神經(jīng)營養(yǎng)因子（anti neurotrophinic factor，NGF）、NLRP3、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、ASC 和IL-1β 4℃過夜。TBST 洗滌（含Tween-20的Tris緩沖鹽水），加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（二抗）37℃反應(yīng)1 h，洗膜，ECL曝光，Quantity one 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6 ELISA 按照試劑說明書，測(cè)量血清中細(xì)胞因子5-HT、5-HIAA、iNOS、IL-6 和TNF-α 表達(dá)。Bio-Rad 酶標(biāo)儀測(cè)定光密度。采用ELISA 試劑盒提供的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多重性比較采用Duncan 法，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 綠原酸對(duì)Aβ 誘導(dǎo)的AD 小鼠神經(jīng)損傷及腦含水量的影響 神經(jīng)損傷評(píng)分結(jié)果表明，Aβ 誘導(dǎo)的AD 小鼠神經(jīng)損傷評(píng)分為（2.73±0.40）分，綠原酸治療后，小鼠神經(jīng)損傷程度顯著下調(diào)（P<0.05）。腦含水量檢測(cè)結(jié)果表明，Aβ 誘導(dǎo)的AD 小鼠腦含水量為（88.61±6.38）%，綠原酸治療后小鼠腦含水量顯著下調(diào)（P<0.05，圖1）。

圖1 小鼠神經(jīng)損傷評(píng)分及腦含水量Fig.1 Neurologic deficit score and cerebral water content of mice

2.2 綠原酸對(duì)Aβ 誘導(dǎo)的AD 小鼠海馬體病理損傷的影響 HE 染色結(jié)果表明，模型組小鼠海馬體椎體細(xì)胞神經(jīng)元萎縮，細(xì)胞空泡化，細(xì)胞疏松。綠原酸治療后，小鼠上述情況明顯緩解（圖2）。

圖2 HE染色觀察小鼠海馬體病理學(xué)變化（×400）Fig.2 Hippocampus pathology of mice detected by HE staining（×400）

2.3 綠原酸對(duì)Aβ 誘導(dǎo)的AD 小鼠BDNF、NGF、5-HT 和5-HIAA 表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果表明，模型組小鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF 和NGF 表達(dá)下調(diào)（P<0.05），綠原酸治療后，BDNF和NGF蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）。ELISA 結(jié)果表明，模型組小鼠5-HT 和5-HIAA 表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），綠原酸治療后，5-HT和5-HIAA表達(dá)上調(diào)（P<0.05，圖3）。

圖3 小鼠腦組織中BDNF、NGF、5-HT 和5-HIAA 蛋白表達(dá)Fig.3 Protein expressions of BDNF，NGF，5-HT and 5-HIAA in mice brain tissue

2.4 綠原酸對(duì)Aβ 誘導(dǎo)的AD 小鼠細(xì)胞因子的影響 ELISA 結(jié)果表明，模型組小鼠外周血中促炎因子iNOS、IL-6 和TNF-α 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），綠原酸治療后，外周血中促炎因子iNOS、IL-6和TNF-α表達(dá)下調(diào)（P<0.01，圖4）。

圖4 小鼠外周血細(xì)胞因子表達(dá)Fig.4 Cytokine expressions in peripheral blood of mice

2.5 綠原酸對(duì)Aβ誘導(dǎo)的AD 小鼠NLRP3炎癥小體活化的影響 Western blot 結(jié)果表明，模型組小鼠NLRP3、ASC 和IL-1β 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），綠原酸治療后，NLRP3、ASC 和IL-1β 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05，圖5）。

圖5 小鼠腦組織中NLRP3、ASC和IL-1β蛋白表達(dá)Fig.5 Protein expressions of NLRP3，ASC and IL-1β in mice brain tissue

3 討論

AD 是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病。本研究采用綠原酸治療后，Aβ 誘導(dǎo)的AD 小鼠神經(jīng)損傷程度顯著下調(diào)，腦含水量顯著下調(diào)。半邊花丁醇治療可改善AD 相關(guān)認(rèn)知和行為障礙[18］。已有研究表明，綠原酸可通過阻止酒精誘導(dǎo)的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12 細(xì)胞凋亡，從而提高細(xì)胞活力和促進(jìn)細(xì)胞分化[19］。綠原酸可通過調(diào)節(jié)炎癥因子、缺氧因子和神經(jīng)生長因子保護(hù)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠[20］。綠原酸對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，主要通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)的Nrf2 通路發(fā)揮作用[21］。研究表明，綠原酸可預(yù)防APP/PS2 轉(zhuǎn)基因AD 小鼠認(rèn)知能力障礙并減少Aβ 斑塊沉積，說明綠原酸對(duì)腦組織具有保護(hù)作用[22］。

本研究中模型組小鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF 和NGF 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，綠原酸治療后BDNF 和NGF 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)模型組小鼠5-HT 和5-HIAA表達(dá)顯著下調(diào)，綠原酸治療后，5-HT和5-HIAA表達(dá)均上調(diào)。已有研究表明，AD中NGF和BDNF水平下降，尤其在AD 早期，這兩種神經(jīng)細(xì)胞因子由于NGF 代謝改變和膽堿能突觸損失而缺失[23］。5-HT參與AD病理過程，AD患者血清中5-HT表達(dá)顯著下調(diào)[24］。5-HIAA可誘導(dǎo)腦啡肽酶改善AD小鼠記憶能力，促進(jìn)內(nèi)肽酶腦啡肽酶生成，從而緩解AD 癥狀[25］。本研究表明，綠原酸可促進(jìn)BDNF、NGF、5-HT和5-HIAA上調(diào)，從而緩解AD小鼠癥狀。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體對(duì)外來傷害性刺激的一種防御反應(yīng)，適度炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用。但顱腦損傷等強(qiáng)烈刺激導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過量炎癥因子，炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大，甚至失控，破壞微環(huán)境穩(wěn)定和機(jī)體平衡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和功能缺失，且可能長期存在慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)[26］。敲除AD 小鼠NLRP3可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞抗炎作用，有利于小膠質(zhì)細(xì)胞清除Aβ蛋白[27］。本研究中模型組促炎因子iNOS、IL-6 和TNF-α 表達(dá)顯著上調(diào)，綠原酸治療后，3 種促炎因子表達(dá)顯著下調(diào)。同時(shí)模型組NLRP3、ASC 和IL-1β表達(dá)顯著上調(diào)，綠原酸治療后，NLRP3、ASC 和IL-1β蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。最近研究表明，炎癥可能與神經(jīng)退行性癡呆有關(guān)。細(xì)胞免疫成分，如小膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞，可介導(dǎo)炎癥分子釋放，包括TNF、生長因子、黏附分子或趨化因子[28］。雖然炎癥在AD發(fā)病機(jī)制中的作用尚未明確，但I(xiàn)L-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子已被證實(shí)參與AD 發(fā)病機(jī)制。雖然免疫系統(tǒng)有助于保護(hù)大腦，但免疫分子失衡也可能在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用[29-30］。炎癥小體組成部分NLRP1、NLRP3、ASC 和caspase-1，以及下游效應(yīng)器IL-1β 和IL-18 等在AD 患者mRNA 和蛋白水平均顯著上調(diào)[31］。Aβ 可激活小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的機(jī)理是Aβ 促進(jìn)IL-1β 成熟，激活一系列炎癥活動(dòng)。研究表明，NLRP3 炎癥小體缺失可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 表型轉(zhuǎn)變從而減少Aβ 在AD 模型中的沉積[32］。已有研究表明，急性肝損傷中綠原酸可抑制NLRP3 炎癥小體激活，降低Pro-caspase-1、caspase-1、Pro-IL-1β 和IL-1β 蛋白表達(dá)。此外，綠原酸還可降低血清和肝臟TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA表達(dá)，與本研究結(jié)果一致[33］。綠原酸可能通過降低焦慮相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)，改善咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠焦慮行為，抑制皮膚炎癥反應(yīng)[34］。杜仲綠原酸通過抑制NF- κB P65 活化減弱LPS 誘導(dǎo)的HRECs 細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[35］。本研究表明，綠原酸可抑制Aβ 誘導(dǎo)的AD 炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)綠原酸可緩解Aβ 誘導(dǎo)的AD 小鼠神經(jīng)損傷，抑制炎癥反應(yīng)，激活NLRP3炎癥小體。本研究僅為體內(nèi)試驗(yàn)的初步探討，綠原酸具有AD 治療效果，為進(jìn)一步研究綠原酸藥理學(xué)功能提供依據(jù)。