郜亮 賈振宇（長治醫(yī)學院附屬和濟醫(yī)院皮膚性病科，長治046000）

皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carci‐noma，CSCC）是一種表皮角質(zhì)形成細胞衍生的皮膚腫瘤，是世界上最惡性的皮膚腫瘤之一［1］。主要表現(xiàn)為一系列的進展性惡性腫瘤，從前體光化角質(zhì)病到原位鱗狀細胞癌、浸潤性鱗狀細胞癌，最后到轉(zhuǎn)移性鱗狀細胞癌［2］。TSPAN1定位于人類染色體1p34.1，屬于四跨膜蛋白超家族新成員，在多種腫瘤組織及細胞中均有表達，其機制可能是通過轉(zhuǎn)導細胞分裂的信號或引起細胞異向分化或去分化，導致癌組織細胞增殖或血管生成等，參與癌變和侵襲轉(zhuǎn)移過程［3］。CHEN等［4］發(fā)現(xiàn)抑制TSPAN1基因表達能夠減少CSCC的增殖、遷移和浸潤等惡性生物學行為。本研究從miRNA靶向基因?qū)膊∵M展進行調(diào)控的角度出發(fā)，探討可能影響TSPAN1表達的miRNA，選中miR-194-5p作為研究點。

miR-194-5p參與乳腺癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌等多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，其上調(diào)往往能夠抑制癌細胞的遷移與侵襲等［5-9］。WANG等［10］曾證明miR-194-5p與TSPAN1之間的靶向關(guān)系，闡明miR-194-5p作為上游因子調(diào)控TSPAN1表達，從而對癌細胞產(chǎn)生影響。但是其在CSCC中的作用并未完全明確。本研究在前人研究的基礎上提出假設：miR-194-5p能夠靶向抑制TSPAN1的表達進而調(diào)控CSCC的進展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源與試劑CSCC A431細胞系購自ATCC細胞庫；蘇木精-伊紅染色試劑盒（G1120）、DAB（DA1010）、RIPA裂解液（R0010）、DEME高糖型培養(yǎng)基（11995）購自索萊寶科技有限公司；兔抗人一抗TSPAN1（ab254730）、Bax（ab32503）、c-myc（ab32072）、Bcl-2（ab32124）、羊 抗 兔IgG二 抗（ab150077）和Annexin V-FITC試劑盒（ab14085）均購自Abcam公司；光鏡（37XF-PC）購自上海光學儀器廠；RNA提取試劑盒（10296010）、Lipofectamine2000（11668027）、無血清培養(yǎng)基Opti-MEMI（31985-070）購自Invitrogen公司；PrimeScript RT試劑盒（RR014A）購自寶日醫(yī)生物科技公司；qRT-PCR引物序列由華大基因合成；PCR試劑盒（KR011A1）購自北京天根生化科技有限公司；BCA試劑盒（23227）購自Thermo Fisher；ECL試劑盒（36208ES60）購自Amersham Life Sciences公司；雙熒光素酶試劑盒（E2920）購自Pro‐mega；細胞轉(zhuǎn)染序列均購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；MTT溶液（GL0247）購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.1.2 主要儀器酶標儀（SP-Max 3500FL）購自上海閃譜生物科技有限公司；24孔板8 μm Transwell小 室（3413）購 自Corning公 司；Matrigel基 質(zhì) 膠（40111ES08）購自Sigma公司；倒置顯微鏡（YKDZ-55）購自上海永科光學儀器有限公司；流式細胞儀（CytoFLEX）購自貝克曼庫爾特。

1.2 方法

1.2.1 研究對象收集我院2017年至2019年根據(jù)臨床表現(xiàn)及組織病理明確診斷的患者病變組織及正常皮膚組織：CSCC共82例（男49例，女33例），作為Model組，年齡38~79歲，平均（62.15±11.47）歲。CSCC組中高分化38例，中分化25例，低分化19例。手術(shù)前均未進行過放療、化療及其他特殊治療，且無免疫性疾病及系統(tǒng)性疾病。所有CSCC組織及正常皮膚組織樣本均切成小塊后迅速置于凍存管中液氮保存，后移至-80℃冰箱。該實驗所有患者均對實驗知情同意，并簽署知情同意書，且通過我院臨床試驗倫理委員會同意。

1.2.2 HE染色所有的標本經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，HE染色步驟：二甲苯脫蠟2次每次15 min；無水乙醇5 min 2次；90%乙醇5 min；80%乙醇5 min；水洗5 min。蘇木素染色：蘇木素液染5 min，水洗至變藍；1%鹽酸乙醇快速分化，水洗至變藍。脫水、透明、封片：80%乙醇5 min；90%乙醇5 min；無水乙醇5 min 2次；二甲苯15 min 2次；中性樹膠封片。HE染色光鏡病理組織學檢查并攝片，觀察各組顯色情況。在形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)上，在400倍放大倍數(shù)下取不同組別，并隨機采集圖像，實驗重復3次。

1.2.3 免疫組織化學檢測TSPAN1蛋白陽性表達率取10%的甲醛固定標本，石蠟包埋連續(xù)切片厚4 μm。將組織切片放入60℃溫箱烘1 h，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。高溫高壓下用檸檬酸修復，1 800 W加熱切片，噴氣后改為1 000 W繼續(xù)加熱2 min，關(guān)掉電磁爐后，自然冷卻10 min，用自來水冷卻10 min，開高壓鍋蓋，逐漸用自來水冷卻切片。0.2 mol/L PBS溶液（pH7.4）洗5 min×3次，擦干切片，滴加入兔抗人TSPAN1多克隆抗體，4℃孵育過夜，0.2 mol/L PBS溶液（pH7.4）洗5 min，共3次；擦干切片后，加入過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育15 min；配制顯色劑，將DAB的A、B、C試劑各l滴加入1 ml蒸餾水中，混勻，置4℃冰箱保存；0.2 mol/L PBS溶液（pH7.4）洗5 min，共3次；DAB顯色，室溫暗室保存8 min；用自來水充分沖洗后，蘇木紫浸染、脫水、透明、封片，光鏡觀察。陰性細胞核為藍色或淺藍色，陽性細胞核為黃色或棕黃色，采用日本Nikon圖像分析軟件進行陽性細胞計數(shù)，每張切片選取3個等面積不重復的視野（200倍），計算陽性細胞數(shù)量，陽性表達率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.4 qRT-PCR檢測采用RNA提取試劑盒提取組織中總RNA，鑒定RNA純度和完整性后，采用PrimeScript RT試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設計miR-194-5p、TSPAN1、c-myc、Bcl-2、Bax、內(nèi)參U6和GAPDH引物，交由華大基因合成（表1）。按PCR試劑盒操作步驟進行qRT-PCR反應。miR-194-5p的相對表達水平以U6為內(nèi)參，TSPAN1、c-myc、Bcl-2、Bax相對表達水平以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法檢測各組基因的表達量并進行比較。（該實驗同樣適用于細胞實驗）。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.5 Western blot檢測各組蛋白表達水平分組收集轉(zhuǎn)染48 h后細胞，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，以12 000 r/min、4℃離心20 min，取上清液分裝備用。按照BCA試劑盒說明書操作測定總蛋白含量后分裝，置于-80℃冰箱冷凍，待用。分別取各組50 μg蛋白，加入蛋白質(zhì)變性劑后行SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、過夜后，PBST漂洗（5 min×3次），分別加入一抗兔抗人TSPAN1、Bax、c-myc、Bcl-2抗體。37℃孵育2 h，PBST漂洗（10 min×3次），加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，37℃孵育2 h，PBST充分漂洗（10 min×3次）后，化學熒光法顯色，使用Image J灰度分析軟件對Western blot檢測結(jié)果作半定量分析。以GAPDH作內(nèi)參，以目標條帶與內(nèi)參照條帶的灰度值之比作為蛋白質(zhì)的相對表達水平。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗生物學預測網(wǎng)站Targetscan分析TSPAN1的靶向miRNA，人工合成TSPAN1 3'UTR基因片段利用內(nèi)切酶位點SpeⅠ和HindⅢ引入pMIR-reporter中，在TSPAN1野生型上設計種子序列的互補序列突變位點，通過限制性內(nèi)切酶酶切后使用T4 DNA連接酶將目的片段插入pMIR-reporter報告質(zhì)粒。將測序正確的熒光素酶報告質(zhì)粒WT、MUT分別與miR-194-5p共轉(zhuǎn)染至細胞HEK-293T。轉(zhuǎn)染48 h后收集并裂解細胞，分別使用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.7 細胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染將人正常皮膚細胞和人A431細胞貼壁培養(yǎng)于DMEM（高糖型）完全培養(yǎng)基（含100 U/ml青霉素、10%小牛血清、100 μg/ml鏈霉素）中，置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每1~2 d換液1次，細胞為單層貼壁生長，到長滿瓶底時，用0.25%胰蛋白酶消化為單個細胞，獲取對數(shù)生長期的細胞準備實驗。

選擇第3代細胞分為7組：Normal組，Blank組（空白對照組）、negative control（NC）組（陰性對照）、miR-194-5p agomir組（轉(zhuǎn)染miR-194-5p agomir）、miR-194-5p antagomir組（轉(zhuǎn)染miR-194-5p antagomir）、shRNA-TSPAN1組（轉(zhuǎn)染shRNA-TSPAN1）、miR-194-5p agomir+shRNA-TSPAN1組（轉(zhuǎn)染miR-194-5p agomir和shRNA-TSPAN1）。將處于對數(shù)生長期的A431細胞接種于6孔板，細胞密度生長至30%~50%，按li‐pofectamin 2000說明書轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染步驟依據(jù)試劑盒說明書進行。

1.2.8 MTT法檢驗各組細胞轉(zhuǎn)染后增殖能力變化取處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細胞以1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)基體積200 μl。細胞貼壁24 h，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h、48 h及72 h，每孔加20 μl MTT溶液（5 mg/ml），37℃孵育4 h，棄上清液，每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，酶標儀測490 nm各孔光吸收值OD，實驗重復3次，取3次結(jié)果的平均值，記錄結(jié)果。

1.2.9 Transwell檢測取各組侵襲轉(zhuǎn)染48 h后的細胞于無血清培養(yǎng)基中饑餓12 h后消化，PBS沖洗2遍，用含10 g/L BSA（牛血清白蛋白）的無血清培養(yǎng)基Opti-MEMI重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為2×106個/ml。實驗采用24孔板8 μm Transwell小室，每組3個小室，實驗前在小室鋪50 μl Matrigel基質(zhì)膠，48 h后在Transwell小室上室分別加入各組細胞的單細胞懸液200 μl（4×104個細胞），而小室下室加入650 μl含10% FBS的G-DMEM培 養(yǎng) 液，置 于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。取出小室后，PBS淋洗，后置于甲醇溶液中，室溫下固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽小心擦去微孔膜上層細胞，于倒置光學顯微鏡下觀察并采集圖像，隨機選取4個視野，計算穿過微孔膜的細胞數(shù)，計算平均值。實驗重復3次。

1.2.10 流式細胞術(shù)分析細胞凋亡率Annexin VFITC/PI雙標染色檢測細胞凋亡，將處理好的細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細胞，PBS溶液洗滌2次后離心將細胞重懸于200 μl結(jié)合緩沖液中，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混合液，避光室溫反應15 min，加入300 μl結(jié)合緩沖液，用流式細胞儀以激發(fā)波長488 nm檢測細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件（USA）處理，計量資料采用±s的形式表示，兩組間比較為t檢驗，多組間比較應采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有顯著性統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果HE染色結(jié)果顯示，正常皮膚組織基底層和角質(zhì)層有明顯分層，細胞核完整清晰，而CSCC組織中組織切片表皮層明顯增厚，基底層與角質(zhì)層之間的分層界限基本消失，角質(zhì)層細胞角化不完全，細胞核形態(tài)也發(fā)生改變（圖1）。

圖1 正常皮膚組織和CSCC組織病理學觀察Fig.1 Histopathological view of normal skin tissue and CSCC tissue

2.2 CSCC組織中TSPAN1表達增高與正常皮膚組織相比［陽性率（14.75±2.14）%］，CSCC組織中TSPAN1細胞陽性率為（78.47±6.51）%，其表達顯著上調(diào)（P<0.05）。提示TSPAN1可能參與了CSCC的進展。見圖2。

圖2 CSCC組織中TSPAN1表達增強Fig.2 TSPAN1 expression was up-regulated in CSCC tissue

2.3 TSPAN1為miR-194-5p的靶基因生物學預測網(wǎng)站Targetscan及microRNA org發(fā)現(xiàn)miR-194-5p、miR-27a、miR-27b為TSPAN1的共有靶miRNA（圖3A），檢測Normal組織及CSCC組織中miR-194-5p、miR-27a、miR-27b的表達發(fā)現(xiàn)miR-194-5p在CSCC組織中表達降低最明顯（圖3B），表明miR-194-5p可能在CSCC進展中扮演重要角色，因此選擇miR-194-5p進行后續(xù)研究，通過雙熒光素酶報告實驗證實了miR-194-5p和TSPAN1之間的靶向關(guān)系（圖3C）。

圖3 miR-194-5p在CSCC組織中表達降低且TSPAN1為miR-194-5p的靶基因Fig.3 miR-194-5p expression was down-regulated in CSCC tissue and TSPAN1 is a target of miR-194-5p

2.4 激活miR-194-5p或抑制TSPAN1的表達抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化檢測各組細胞miR-194-5p、TSPAN1以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子的表達，結(jié)果表明，相對于Blank組，激活miR-194-5p或沉默TSPAN1能夠上調(diào)E-cadherin的mRNA和蛋白表達，下調(diào)Vimentin及N-cadherin的mRNA和蛋白表達（均P<0.05）。抑制miR-194-5p則會上調(diào)Vimentin及N-cadherin的mRNA和蛋白 表 達，下調(diào)E-cadherin的mRNA和蛋白表達（均P<0.05）。NC組和Blank組各指標差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。見圖4。提示干預miR-194-5p或TSPAN1的表達能夠影響CSCC細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

2.5 激活miR-194-5p或抑制TSPAN1的表達抑制A431細胞增殖活力qRT-PCR、Western blot及MTT檢測結(jié)果顯示，相對于Normal組，其余組中Bax表達降低，Bcl-2表達增高，細胞增殖活力增強（均P<0.05）。相對于Blank組，激活miR-194-5p表達或沉默TSPAN1能夠促進Bax表達，抑制Bcl-2表達，抑制細胞活力的增強，且miR-194-5p agomir+shRNATSPAN1組效果更明顯（均P<0.05）。抑制miR-194-5p表達則相反（均P<0.05）。NC組和Blank組各指標差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05）。見圖5。提示干預miR-194-5p或TSPAN1表達能夠影響A431細胞增殖活力，并影響凋亡相關(guān)因子表達。

圖5 各組細胞Bax、Bcl-2表達及增殖活力檢測結(jié)果Fig.5 Results of expressions of Bax，Bcl-2 and prolifera?tion activity

2.6 激活miR-194-5p或抑制TSPAN1的表達抑制A431細胞侵襲Transwell侵襲實驗檢測各組細胞侵襲過膜情況，結(jié)果顯示，相對于Normal組，其余各組細胞侵襲能力顯著增強（均P<0.05）。相對于Blank組，激活miR-194-5p表達或抑制TSPAN1表達能夠抑制細胞增殖侵襲過膜的數(shù)量，且二者聯(lián)合作用效果更明顯（均P<0.05）。抑制miR-194-5p表達能夠促進細胞侵襲（均P<0.05），NC組和Blank組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖6。提示干預miR-194-5p或TSPAN1的表達能夠調(diào)控A431細胞的侵襲。

圖6 過表達miR-194-5p或抑制TSPAN1能夠抑制A431細胞侵襲Fig.6 Overexpression of miR-194-5p or inhibition of TSPAN1 could inhibit invasion of A431 cells

2.7 激活miR-194-5p或抑制TSPAN1的表達促進A431細胞凋亡Annexin V-FITC/PI雙標染色法檢測結(jié)果顯示，與Normal組相比，其他各組細胞凋亡率明顯降低（P<0.05）。相對于Blank組，激活miR-194-5p表達或抑制TSPAN1表達能夠促進細胞凋亡，且聯(lián)合作用效果更明顯（均P<0.05）。抑制miR-194-5p表達能夠抑制細胞凋亡（均P<0.05）。NC組和Blank組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖7。提示干預miR-194-5p或TSPAN1表達能夠影響A431細胞的凋亡。

圖7 過表達miR-194-5p或抑制TSPAN1能夠誘導A431細胞凋亡Fig.7 Overexpression of miR-194-5p or inhibition of TSPAN1 could induce apoptosis of A431 cells

3 討論

CSCC是一種常見的皮膚癌，在陽光照射下表現(xiàn)為鱗狀、紅色或出血性病變，紫外線照射、皮膚白皙和免疫抑制均是其發(fā)病原因，侵襲性CSCC以高發(fā)病率和高死亡率為特征［11-12］。miRNAs是一種內(nèi)源性、非編碼的微小RNA，長度為19~25個核苷酸，參與轉(zhuǎn)錄后的基因表達調(diào)控，miRNA的表達在宮頸癌、肺癌、胃癌等多種癌癥中發(fā)揮重要作用［13-16］。其可通過調(diào)節(jié)一個或多個靶基因發(fā)揮腫瘤抑制或促進作用［17-18］。

目前已有大量關(guān)于miRNA影響CSCC的研究，例如LOHCHAROENKAL等［19］發(fā)現(xiàn)miR-203通過靶向調(diào)節(jié)c-myc的表達在CSCC中起抑癌作用；XU等［20］發(fā)現(xiàn)miR-125b通過靶向調(diào)節(jié)MMP13對CSCC起抑制作用。而作為常見的抑癌miRNA，miR-194-5p以往也被證實在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌miRNA的作用，但目前未見miR-194-5p影響CSCC的報道［5-9］。本研究通過檢測CSCC組織中miR-194-5p的表達，發(fā)現(xiàn)其在CSCC中表達下調(diào)。miRNA通常會與靶基因結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄或促進mRNA降解，進而參與多種疾病的進展，這一現(xiàn)象也被稱為RNAi［21］。本研究希望進一步明確miR-194-5p可能參與CSCC進展的機制并發(fā)現(xiàn)其與TSPAN1存在靶向結(jié)合位點。

據(jù)報道，TSPAN1可加速多種癌癥的進展，特別是胃癌、結(jié)腸癌等消化系統(tǒng)惡性腫瘤，但關(guān)于TSPAN1對CSCC的影響目前未見報道［22-23］。通常TSPAN1在癌癥組織中表達上調(diào)，促進癌細胞的生長、遷移和侵襲，抑制其表達則會抑制癌細胞的惡性進展［24］。與既往研究結(jié)果一致，本研究通過免疫組織化學實驗發(fā)現(xiàn)TSPAN1在CSCC組織中的陽性表達顯著上調(diào)，并且確定了miR-194-5p與TSPAN1之間的靶向關(guān)系；之后又通過一系列實驗發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-194-5p或下調(diào)TSPAN1表達能夠抑制CSCC細胞的增殖、侵襲，加速細胞凋亡，且將miR-194-5p過表達和TSPAN1沉默聯(lián)合作用效果更加明顯。除檢測各組細胞的生物學行為變化外，本研究還檢測了各組細胞中凋亡及EMT相關(guān)因子的表達，以期明確影響細胞生物學行為變化的原因。結(jié)果表明，過表達miR-194-5p或沉默TSPAN1的表達能夠促進Bax、抑制Bcl-2，并改善EMT相關(guān)因子變化情況，這也進一步證實了miR-194-5p/TSPAN1在CSCC中的作用。

綜上所述，miR-194-5p通過靶向調(diào)控TSPAN1基因抑制A431細胞的EMT、增殖、侵襲，促進細胞凋亡，這將為CSCC的診斷和治療提供一定的參考。但本研究也存在一定的局限性：本研究僅探討了體外miR-194-5p/TSPAN1如何影響CSCC的進展，未進行相關(guān)的體內(nèi)實驗，這也是課題組后期要進一步完善的地方。