朱琳琳 徐祉軒 張明明（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南省分子檢驗(yàn)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，河南省免疫與靶向藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng)453003）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）發(fā)病率逐年升高，現(xiàn)已成為嚴(yán)重威脅亞洲男性健康的第二大惡性腫瘤，但相當(dāng)一部分患者激素治療不敏感或耐受，迫切需要尋找抗腫瘤效果明確但不良反應(yīng)較小的藥物。本研究選取的藍(lán)萼甲素（glaucocalyxin A，GLA）是從傳統(tǒng)中草藥香茶菜中分離提取的活性成分，香茶菜作為中草藥，用于清熱解毒、抗菌消炎、抗腫瘤歷史悠久。研究表明GLA具有良好的抗腫瘤作用，但機(jī)制尚不明確［1-4］。本研究檢測(cè)GLA對(duì)人前列腺癌細(xì)胞系DU145細(xì)胞中周期蛋白B1（cy‐clinB1）、周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent ki‐nase1，CDK1）等細(xì)胞周期相關(guān)因子表達(dá)的影響，探討GLA誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的作用機(jī)制，為GLA的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人前列腺癌細(xì)胞系DU145細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液購自Gibco公司；GLA由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；所用引物均由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成；所用抗體均購自美國CST公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、流式細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；流式凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、1 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml GLA組，4組細(xì)胞培養(yǎng)基均含10%胎牛血清、100 U/ml雙抗（青鏈霉素），培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2?？瞻讓?duì)照組不加GLA，其他各組細(xì)胞貼壁后分別加入相應(yīng)濃度GLA刺激培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖4組細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積100 μl，約2 000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后加藥。各孔分別加入10 μl CCK-8溶液，96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出96孔板，置于酶標(biāo)儀檢測(cè)位，振蕩混勻后，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定各孔標(biāo)本吸光度。

1.2.3 細(xì)胞周期細(xì)胞接種于6孔板中，約1×106個(gè)/孔，各孔細(xì)胞數(shù)量均勻。細(xì)胞貼壁后加藥，加藥后培養(yǎng)24 h，按試劑盒操作說明收集固定細(xì)胞，染色，上機(jī)檢測(cè)分析。

1.2.4 細(xì)胞凋亡細(xì)胞接種于6孔板中，約1×106個(gè)/孔。細(xì)胞貼壁后加藥培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，Binding Buffer重懸細(xì)胞，Annex‐in V-FITC標(biāo)記后避光、室溫孵育15 min，PI染色后上機(jī)檢測(cè)分析。

1.2.5 Real-time PCR Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，異丙醇法濃縮RNA，對(duì)RNA濃度和質(zhì)量檢測(cè)后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并按試劑盒操作說明完成qRTPCR。qRT-PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s與60℃退火/延伸60 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后分析熔解曲線，采用2-ΔΔCt法（其中Ct值為循環(huán)閾值）分析mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。所用引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primers used in real-time PCR

1.2.6 Western blot提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后依次轉(zhuǎn)膜、室溫封閉、孵育一抗（p21、cyclinB1、CDK1為1∶1 000稀釋）4℃過夜、孵育HRP-二抗（1∶5 000稀釋）室溫?fù)u床1 h，洗膜后曝光掃描，以目的蛋白與β-actin蛋白條帶灰度值的比值，作為其相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 免疫熒光采用爬片：在24孔板中培養(yǎng)DU145細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后加藥刺激24 h，PBS洗滌細(xì)胞后4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.5%TritonX-100室溫通透15 min，室溫封閉90 min，一抗孵育（cyclinB1、CDK1分別為1∶400、1∶100稀釋），4℃過夜，熒光二抗（1∶400稀釋）室溫避光孵育1 h，DAPI染色，應(yīng)用熒光顯微鏡檢測(cè)蛋白在細(xì)胞中的定位分布。

2 結(jié)果

2.1 GLA抑制DU145細(xì)胞增殖各組細(xì)胞按相應(yīng)藥物濃度分別刺激培養(yǎng)1 h、6 h、12 h、24 h、48 h，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1 μg/ml GLA對(duì)細(xì)胞增殖的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；2.5 μg/ml與5 μg/ml GLA能夠抑制細(xì)胞增殖，5 μg/ml GLA的抑制效果更為顯著（P<0.01），見圖1?？梢奊LA抑制DU145細(xì)胞增殖的作用呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

圖1 DU145細(xì)胞增殖曲線Fig.1 Proliferation curve of DU145 cells

2.2 GLA阻滯DU145細(xì)胞周期與對(duì)照組相比，1 μg/ml GLA對(duì)細(xì)胞周期的影響并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著濃度增加，GLA顯現(xiàn)出阻滯細(xì)胞周期的作用，當(dāng)5 μg/ml GLA刺激培養(yǎng)DU145細(xì)胞24 h后，細(xì)胞周期明顯停滯于G2/M期（P<0.01），見圖2。GLA阻滯DU145細(xì)胞周期的作用呈現(xiàn)出明顯劑量依賴效應(yīng)。

圖2 GLA引發(fā)DU145細(xì)胞G2/M期阻滯Fig.2 GLA induces G2/M cell cycle arrest in DU145 cells

2.3 GLA調(diào)節(jié)DU145細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)1 μg/ml GLA刺激培養(yǎng)細(xì)胞24 h，與對(duì)照組相比，p21、cy‐clinB1、CDK1 mRNA與蛋白的表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但隨著濃度的增加，2.5 μg/ml GLA能夠促進(jìn)p21的表達(dá)，并抑制cyclinB1與CDK1的表達(dá)；5 μg/ml GLA的作用效果更為明顯，在顯著促進(jìn)p21表達(dá)的同時(shí)，更加抑制了cyclinB1與CDK1的表達(dá)，且qRTPCR與Western blot的結(jié)果基本一致，見圖3。可見GLA調(diào)節(jié)DU145細(xì)胞周期相關(guān)因子的表達(dá)，在mRNA與蛋白水平上均表現(xiàn)出劑量效應(yīng)。

圖3 GLA調(diào)節(jié)DU145細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.3 GLA regulate cell cycle relative protein expression in DU145 cells

圖5 GLA促進(jìn)DU145細(xì)胞凋亡Fig.5 GLA promote DU145 cells apoptosis

2.4 免疫熒光驗(yàn)證DU145細(xì)胞周期蛋白的定位表達(dá)免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了Western blot的結(jié)果，細(xì)胞周期蛋白cyclinB1、CDK1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，5 μg/ml GLA能夠顯著抑制cyclinB1、CDK1的表達(dá)（見圖4）。GLA引起DU145細(xì)胞周期阻滯與其抑制cyclinB1、CDK1表達(dá)的作用效果及劑量效應(yīng)完全一致，因此推測(cè)GLA極有可能通過抑制cyclinB1、CDK1的表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。

圖4 DU145細(xì)胞周期蛋白細(xì)胞內(nèi)表達(dá)（×400）Fig.4 Localization of cell cycle relative protein in DU145 cells（×400）

2.5 GLA誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡GLA阻滯細(xì)胞周期后極有可能引發(fā)細(xì)胞生物學(xué)行為發(fā)生變化。流式檢測(cè)結(jié)果顯示：2.5 μg/ml GLA作用于細(xì)胞，雖然能引起凋亡增加，但與對(duì)照組相比并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），5 μg/ml GLA才顯 示 出促 凋 亡 效 果（P<0.01）。

3 討論

前列腺癌為常見惡性腫瘤，近年來隨著經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高，人口老齡化進(jìn)一步明顯，我國前列腺癌患者呈逐年上升趨勢(shì)［5-6］。大多數(shù)前列腺癌發(fā)病隱匿、進(jìn)程緩慢，就診時(shí)往往已是中晚期，臨床多用雄激素治療，但很多患者治療后期出現(xiàn)激素不敏感或耐受，最終腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散［7］。因此迫切需要尋找抗腫瘤效果明確但不良反應(yīng)少的藥物。

傳統(tǒng)中草藥一直以其活性強(qiáng)、毒性小備受關(guān)注，其中香茶菜在民間應(yīng)用歷史悠久［1-4］，已用于臨床的冬凌草就是從香茶菜中提取的活性成分，本研究選取的GLA則是香茶菜的另一種活性成分。前期研究發(fā)現(xiàn)，小劑量GLA能夠通過IL-6激活Stat3信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與侵襲遷移［8-9］。中草藥往往對(duì)細(xì)胞功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，研究也表明GLA具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用［3-4］。因此，本研究采用較高濃度GLA作用于前列腺癌DU145細(xì)胞，探討GLA抗腫瘤的作用機(jī)制。

增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2.5、5 μg/ml GLA作用于DU145細(xì)胞24 h后，可以抑制DU145細(xì)胞的增殖，尤以5 μg/ml GLA的作用效果更為顯著。與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致的是，與對(duì)照組相比，1 μg/ml GLA對(duì)細(xì)胞增殖的影響作用并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果均提示GLA抑制細(xì)胞增殖的作用呈劑量效應(yīng)及時(shí)間依賴性。增殖與細(xì)胞周期關(guān)系密切，周期紊亂可以引起增殖異常。

細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1 μg/ml GLA對(duì)細(xì)胞周期基本無影響。隨著濃度增加，2.5 μg/ml GLA表現(xiàn)出阻滯作用，5 μg/ml GLA的阻滯作用尤為顯著，G2期細(xì)胞達(dá)44.3%，整體上凸顯G2/M期阻滯。G1期到S期、G2期到M期是復(fù)雜活躍的分子水平變化時(shí)期，容易受環(huán)境條件影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能夠抑制DU145細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變，從而抑制其增殖［10］。本研究結(jié)果提示GLA能夠顯著影響DU145細(xì)胞從G2期向M期的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期，抑制其增殖。

參與細(xì)胞周期調(diào)控的蛋白主要有S、M、G1期蛋白與CDK激酶。cyclin B為M期周期蛋白，從S期開始表達(dá)，在G2/M期到達(dá)峰值，后期消失。CDK1的活化依賴于cyclinB1，cyclinB1與CDK1結(jié)合并激活CDK1可以促進(jìn)細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期［11］。p21則是CDK激酶的抑制劑，能夠抑制cyclinB1/CDK的激活，阻滯細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)變［12］。鑒于GLA引發(fā)G2/M期阻滯，因此本研究進(jìn)一步對(duì)p21、cyclinB1、CDK1進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，5 μg/ml GLA作用DU145細(xì)胞24 h，促進(jìn)p21表達(dá)的同時(shí)，顯著抑制cyclinB1、CDK1的 表 達(dá)。GLA對(duì)p21與cyclinB1/CDK1的 作用效果正好相反。與此一致的是，LIN等［13］研究發(fā)現(xiàn)，GLA能夠通過促進(jìn)/抑制p21、Cdc25C等周期蛋白的表達(dá)，阻滯膀胱癌UMUC3的細(xì)胞周期。免疫熒光進(jìn)一步印證了Western blot結(jié)果。與對(duì)照組相比，5 μg/ml GLA刺激培養(yǎng)24 h，DU145細(xì)胞質(zhì)中cyclinB1與CDK1的表達(dá)明顯增多。因此GLA極有可能通過抑制周期蛋白cyclinB1的表達(dá)，影響CDK1激酶的活化，進(jìn)而導(dǎo)致G2/M期阻滯。

細(xì)胞周期紊亂會(huì)誘發(fā)凋亡，細(xì)胞周期長時(shí)間停滯也會(huì)誘發(fā)凋亡。流式結(jié)果就顯示出5 μg/ml GLA能夠引起DU145細(xì)胞凋亡，提示GLA引起周期阻滯的同時(shí)，也誘發(fā)了凋亡。已有研究發(fā)現(xiàn)，GLA能夠抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，導(dǎo)致p21、Bax蛋白累積，繼而激活下游信號(hào)通路，引起細(xì)胞周期阻滯和凋亡［13-15］。本研究結(jié)果也顯示GLA誘發(fā)G2/M期阻滯與p21蛋白增多相關(guān)，提示GLA極有可能通過p21蛋白信號(hào)通路誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡，具體作用機(jī)制在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GLA能夠誘導(dǎo)DU145細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，這一作用極有可能是通過抑制細(xì)胞周期蛋白cyclinB1、CDK1的表達(dá)而誘發(fā)，cyclinB1、CDK1表達(dá)升高進(jìn)一步激活凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因而，控制GLA的作用濃度及作用時(shí)間，有效發(fā)揮其阻滯細(xì)胞周期的作用，對(duì)前列腺癌防治有新的意義和價(jià)值。