羅連響 黃芳芳 吳銳劍 林浩雯 王渠 李曉玲 黃宇戈

（廣東醫(yī)科大學(xué)海洋醫(yī)藥研究院，湛江524023）

阿爾茲海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種重度、慢性、進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，與記憶和認(rèn)知障礙相關(guān)，是老年人癡呆最常見的原因，并可導(dǎo)致死亡［1-2］。據(jù)估計(jì)，截至2018年，全球約有5 000萬人患有AD，預(yù)計(jì)到2050年，AD患者人數(shù)將增加3倍以上，達(dá)1.52億［3］。迄今為止，AD的病理機(jī)制尚未明確，但β-淀粉樣蛋白（Aβ）和微管相關(guān)蛋白tau被認(rèn)為是促進(jìn)AD發(fā)生和發(fā)展的兩個(gè)重要因素，細(xì)胞外Aβ蓄積，神經(jīng)纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白病變是AD的重要病理學(xué)特征［4］。此外，AD還與突觸丟失、特定神經(jīng)遞質(zhì)減少、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元死亡等多種因素有關(guān)［5］。目前，由于AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚未明確，藥物只能在一定程度上緩解AD癥狀，但治療效果不理想，且副作用大［6］。

花青素（cyanidin）是多酚類黃酮類化合物花色苷（anthocyanins）的主要成分之一，在各種花、果、種子和植物葉片中含量豐富，如櫻桃、藍(lán)莓、桑樹、黑接骨木等，并且因其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)保護(hù)作用而備受關(guān)注［7-9］。花青素的神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī)制之一是抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥。據(jù)報(bào)道，花青素可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡產(chǎn)生保護(hù)作用，以及通過抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞TLR4/NOX4下游NF-κB活性來減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥［10-11］。此外，研究表明，攝入花青素可降低AD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［12-13］。因此，探索花青素治療AD的機(jī)制具有重要意義。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在大數(shù)據(jù)醫(yī)學(xué)研究的新模式下產(chǎn)生的，可構(gòu)建多層次網(wǎng)絡(luò)模型，從網(wǎng)絡(luò)角度描述生物系統(tǒng)、藥物和疾病之間的復(fù)雜性，以高通量方式揭示小分子的調(diào)控原理［14-15］。而分子對(duì)接可從已知結(jié)構(gòu)的受體（靶蛋白或活性位點(diǎn)）和配體出發(fā)，按照幾何互補(bǔ)、能量互補(bǔ)以及化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)的原則，進(jìn)行分子間相互作用識(shí)別并預(yù)測(cè)受體-配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)，闡明藥物的作用機(jī)理［16-17］。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析花青素治療AD的相關(guān)靶點(diǎn)以及相關(guān)信號(hào)通路，并通過分子對(duì)接技術(shù)以及體外實(shí)驗(yàn)對(duì)主要靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，為花青素治療AD提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2細(xì)胞購(gòu)自American type culture collection（ATCC）；花青素購(gòu)自MedChem Express（MCE）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和0.25%Trypsin-EDTA（1X）購(gòu)自Gibco；普通RIPA裂解液（組織/細(xì)胞）購(gòu)自Solarbio；抗COX-2抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology（CST）；二氧化碳培養(yǎng)箱（型號(hào)FORMA STERI-CYCLE i160）購(gòu)自美國(guó)Thermo Electron公司；超凈工作臺(tái)（型號(hào)SW-CJ-2D）購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；超分辨激光掃描共聚焦熒光顯微鏡（型號(hào)FV3000）購(gòu)自日本Olympus公司；Gel‐View 6000M多功能圖像工作站（型號(hào)GelView 6000M）購(gòu)自廣州博鷺騰儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物靶點(diǎn)的收集在Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)［18］（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）收集花青素（cyanidin）的相關(guān)信息，并將其結(jié)構(gòu)的SDF文件保存，隨 后 導(dǎo) 入Swisstargetprediction平 臺(tái)［19］（http：//www.swisstargetprediction.ch/）上進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。同時(shí)，在Chembl數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ebi.ac.uk/chembl/g/）和CTD數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//ctdbase.org/）中收集花青素的靶點(diǎn)，去重整合后校正為人源靶點(diǎn)。

1.2.2 疾病靶點(diǎn)收集在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org）和Genecards數(shù) 據(jù) 庫(kù)［20］（http：//Gene‐cards.org）中搜索AD的相關(guān)靶點(diǎn)。為了提高靶點(diǎn)準(zhǔn)確性，取兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄疾病靶點(diǎn)的交集作為疾病的靶點(diǎn)。

1.2.3 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建以及核心靶點(diǎn)的篩選將藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)相互映射，隨后將獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)［21］（https：//stringdb.org/）進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并將該網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入cytoscape3.7.2軟 件，利 用cytoHubba插 件，采 用MCC算法篩選出10個(gè)hub基因。

1.2.4 GO和KEGG富集分析將花青素和AD兩者 的 交 集 靶 點(diǎn) 導(dǎo) 入Metascape平 臺(tái)［22］（https：//metascape.org/）進(jìn)行富集分析，所有結(jié)果富集倍數(shù)均大于1.5，P值均小于0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在GO生物進(jìn)程、GO分子功能以及GO細(xì)胞組分這三個(gè)類別中分別選取富集基因數(shù)最高的前15條GO通路進(jìn)行展示。KEGG通路也根據(jù)富基因數(shù)排列，取前13條通路展示。此外，本研究重點(diǎn)關(guān)注了篩選出的hub基因的富集分析情況，在所有結(jié)果中，抽取出hub基因的富集通路進(jìn)行展示。

1.2.5 分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)研究分子對(duì)接是一個(gè)模擬小分子在大分子活性位點(diǎn)的對(duì)接姿勢(shì)從而預(yù)測(cè)親和力的過程，可用于評(píng)價(jià)藥物活性成分與藥物靶點(diǎn)結(jié)合能力［23-24］。因此，利用AutoDock4對(duì)花青素和靶點(diǎn)PTGS2進(jìn)行分子對(duì)接研究。從Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取化合物花青素的SDF格式（CID：68247），然后使用ChemOffice構(gòu)建化合物的3D結(jié)構(gòu)保存為*mol2格式并使其能量最小化。靶點(diǎn)蛋白方面，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)［25］（http：//www1.rcsb.org/）中獲取PTGS2的3D結(jié)構(gòu)PDB格式文件（PDB ID：3LN1），使用pymol2.3來除去靶點(diǎn)的水分子和使用AutoDock4來添加氫，再使用AutoDock4把化合物和靶點(diǎn)保存為pdbqt格式，隨后運(yùn)用vina程序進(jìn)行對(duì)接，最后使用ligplot2.23來生成2D相互作用力圖以及使用pymol2.3來分析對(duì)接后復(fù)合物的3D模式圖。對(duì)接后，利用分子動(dòng)力學(xué)仿真模擬PTGS2和花青素的復(fù)合物，以檢測(cè)復(fù)合物的穩(wěn)定性和靈活性。本研究使用GROMACS2018.1軟件包和gro‐mos54a7_atbff力場(chǎng)以及SPC216水模型來進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。為了保證模擬系統(tǒng)的總電荷中性，在系統(tǒng)中加入相應(yīng)數(shù)量的鈉離子取代水分子進(jìn)而形成合適尺寸的溶劑盒。然后將周期邊界條件（PBC）應(yīng)用于系統(tǒng)的三個(gè)方向。利用gromos54a7_atb力場(chǎng)，從ATB網(wǎng)站［26］（http：//atb.uq.edu.au/）獲得花青素的力場(chǎng)參數(shù)。最初，整個(gè)系統(tǒng)50 000步的能量在300 k時(shí)被最小化（EM）。隨后通過位置約束的MD模擬，然后通過NVT（粒子的數(shù)目、體積和溫度恒定）和NPT（粒子的數(shù)目、壓力和溫度恒定），實(shí)現(xiàn)受體、配體和溶劑的平衡。最后，對(duì)體系的均方根偏差（RMSD）和原子位置的均方根波動(dòng)（RMSF）進(jìn)行分析，RMSD可通過反映體系里的分散程度進(jìn)而反映復(fù)合物的穩(wěn)定性，而RMSF則通過反映某一個(gè)原子相對(duì)于參考構(gòu)象的結(jié)構(gòu)變化，從而反映原子的自由度（靈活性）。

1.2.6 鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2細(xì)胞的培養(yǎng)和處理BV2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，并于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將BV2細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度接種于12孔板中過夜。第2天將細(xì)胞分為空白對(duì)照組，LPS組以及給藥組（5、10、20 μmol/ml花青素），給藥組先用花青素預(yù)處理0.5 h，0.5 h后在LPS組以及給藥組中加入250 ng/ml LPS共刺激24 h。

1.2.7 Western blot分析如1.2.6所示進(jìn)行藥物處理后，將BV2細(xì)胞用RIPA裂解液裂解以收集細(xì)胞蛋白。將收集的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，置于轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后分別孵育一抗抗體，4℃孵育過夜。第2天洗膜后加入稀釋（1∶4 000）的二抗，室溫孵育1 h。二抗孵育完成后，顯影儀顯影。最后使用Image J軟件通過光密度法對(duì)印跡進(jìn)行定量分析。

1.2.8 免疫熒光法檢測(cè)PTGS2蛋白的表達(dá)提前1 d將BV2細(xì)胞鋪于6孔板，在鋪細(xì)胞之前將無菌的方形蓋玻片加入6孔板。第2天進(jìn)行藥物處理，收樣時(shí)棄去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，然后加入4%多聚甲醛（PFA）室溫固定20 min。棄掉PFA，用PBS在室溫浸洗3次，每次5 min。然后加5 00 μl 0.5%Tri‐ton X-100（PBS配制）室溫破膜15 min，再用PBS浸洗3次，每次5 min。之后用山羊血清封閉0.5 h。去除封閉液后加入PBS浸洗3次，每次5 min。加入相應(yīng)的一抗稀釋液（5%BSA稀釋1∶300），靜置4℃冰箱過夜。第2天回收一抗，加入PBS浸洗3次，每次5 min。然后加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗稀釋液（PBS稀釋1∶1 000）室溫避光1 h。再用PBS避光清洗3次，每次5 min。接著加入DAPI染色液（PBS稀釋1∶2 000）室溫避光10 min。去除DAPI并加入PBS避光清洗3次，每次5 min。最后，準(zhǔn)備好載玻片，并于每張載體玻片中央滴加50 μl抗淬滅封片液，隨后將蓋玻片倒扣于封片液上，4℃避光保存。在激光共聚焦顯微鏡下觀察，并拍照記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用GraphPad Prism 8.3.0軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)信息。所有數(shù)據(jù)均顯示為±s。兩組間的比較采用雙尾t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物及疾病靶點(diǎn)的收集在Chembl數(shù)據(jù)庫(kù)收集到20個(gè)花青素靶點(diǎn)，在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中收集到26個(gè)花青素靶點(diǎn)，在SwissTargetPrediction平臺(tái)收集到99個(gè)花青素靶點(diǎn)。去重合并后共獲得139個(gè)花青素人源靶點(diǎn)。在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)和Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集到2 006個(gè)AD人源靶點(diǎn)。藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集情況用韋恩圖表示，見圖1A。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)以及核心靶點(diǎn)分析將71個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至STRING平臺(tái)即可得到PPI圖，將組織（or‐ganism）設(shè)置為“Homo sapiens”，文件以tsv格式保存，將71個(gè)交集靶點(diǎn)的相互作用信息上傳至Cyto‐scape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化，并利用MCC算法篩選出10個(gè)hub基因。PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖1B）由71個(gè)節(jié)點(diǎn)，562條邊構(gòu)成，其中MCC算法排名前10的靶點(diǎn)依次為：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA），IL-6，原癌基因酪氨酸蛋白激酶src（SRC），腫瘤壞死因子（TNF），信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3），人前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2），基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9），表皮生長(zhǎng)因子（EGFR），雌激素受體alpha（ESR1），絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT（AKT1）。這10個(gè)hub靶點(diǎn)顏色隨著MCC分?jǐn)?shù)從黃色到紅色變化，靶點(diǎn)越接近紅色，MCC分?jǐn)?shù)越高。網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)的拓?fù)浞治鰯?shù)據(jù)見表1。

表1 核心靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)浞治觯ǘ戎蹬判蚯?0個(gè)靶點(diǎn)）Tab.1 Topological analysis of core targets in network(top 10 targets in degree ranking)

圖1 花青素與AD疾病靶點(diǎn)的韋恩圖和交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Venn diagram of cyanidin and AD targets and PPI network of intersection targets

2.3 GO富集分析GO（gene ontology）可從功能、參與的生物途徑、細(xì)胞中的定位，對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行簡(jiǎn)單注釋，因此，通過GO富集分析可以大致了解基因富集在哪些生物學(xué)功能、途徑或細(xì)胞定位，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。本研究使用Metascape平臺(tái)進(jìn)行GO富集分析共得到1 671個(gè)條目（P<0.05），其中包含1 517個(gè)生物進(jìn)程（BP）條目，66個(gè)細(xì)胞組成（CC）條目，88個(gè)分子功能（MF）條目，并展示各部分富集基因數(shù)排名前15的通路，見圖2。不同的顏色代表不同的部分，不同的柱子高度代表不同的基因富集數(shù)，柱子越高，代表基因在通路富集越顯著。在生物進(jìn)程（GO-BP）分析中，基因主要富集在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞參與的各個(gè)反應(yīng)。而通過細(xì)胞組分（GOCC）分析，可以了解到，花青素治療AD的靶點(diǎn)大多集中在膜區(qū)、突觸和軸突區(qū)。在分子功能（GO-MF）分析中可以看出，靶點(diǎn)與各類激酶反應(yīng)相關(guān)。

圖2 花青素與AD交集靶點(diǎn)的GO富集分析圖Fig.2 GO enrichment analysis of intersection target of cyanidin and AD

2.4 KEGG通路富集分析通過使用Metascape平臺(tái)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共得到220條KEGG信號(hào)通路。圖3展示了富集基因數(shù)排名前13的通路?？v坐標(biāo)表示通路名，橫坐標(biāo)代表富集倍數(shù)，氣泡大小代表富集在通路的基因數(shù)，顏色代表P值。結(jié)果顯示，靶點(diǎn)主要富集在PI3K/AKT信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。隨后，從Metascape平臺(tái)上下載的metascape_result.xlsx文件中挑選出與10個(gè)hub基因相關(guān)的通路，并用弦圖展示，見圖4。可見PTGS2和TNF與AD通路聯(lián)系緊密，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

圖3 花青素與AD交集靶點(diǎn)的KEGG通路圖Fig.3 KEGG pathway diagram of intersection target of cyanidin and AD

圖4 10個(gè)hub基因的KEGG通路圖Fig.4 KEGG pathway diagram of 10 hub genes

2.5 花青素與核心靶點(diǎn)PTGS2的分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)研究炎癥反應(yīng)可在AD的病理生理學(xué)中起至關(guān)重要的作用，研究表明，Aβ可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，加劇神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致AD的發(fā)生和發(fā)展，而促炎性酶如環(huán)氧合酶-2（COX2，即PTGS2）的過度表達(dá)會(huì)危及大腦神經(jīng)元的存活［27-29］。本研究發(fā)現(xiàn)PTGS2為花青素治療AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)，且PTGS2與AD通路聯(lián)系緊密。因此，為了進(jìn)一步探討花青素與PTGS2的結(jié)合效果，使用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行研究。在本次對(duì)接研究中，選擇的活性位點(diǎn)是Leu338、Ser339、Arg499、Phe504和Val509，從圖5A中看出花青素與活性位點(diǎn)中的Leu338形成了氫鍵作用；而從圖5B中可以看到花青素與殘基Leu338形成氫鍵相互作用（鍵長(zhǎng)2.77?），與Tyr341、His75、Arg499、Ser339和Val509以及Phe504等殘基形成疏水相互作用；另外，花青素與PTGS2的結(jié)合能為-8.441 kcal/mol。因此，從相互作用和結(jié)合能數(shù)值可以發(fā)現(xiàn)，花青素與PTGS2形成了很緊密的結(jié)合，在結(jié)合強(qiáng)度方面表現(xiàn)非常良好。

圖5 花青素與PTGS2活性位點(diǎn)的結(jié)合模式以及復(fù)合物體系的RMSD和RMSF圖Fig.5 Binding mode of cyanidin and PTGS2 active sites and RMSD and RMSF of complex system

通過分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)花青素與PTGS2結(jié)合效果較好，因此，進(jìn)一步使用分子動(dòng)力學(xué)仿真模擬技術(shù)檢測(cè)花青素與PTGS2復(fù)合物的穩(wěn)定性和靈活性。分子動(dòng)力學(xué)后，課題組獲得了PTGS2和花青素在蛋白質(zhì)方面的RMSD和RMSF的數(shù)據(jù)，其中與第一幀相比，PTGS2和花青素在100 ns的模擬過程中最終在7 ns平衡，并且RMSD數(shù)值為0.225 nm，說明PTGS2和花青素的體系很快達(dá)到了穩(wěn)定且并未出現(xiàn)過多的波動(dòng)（圖5C），而在RMSF方面可以看到整體的RMSF數(shù)值處于0.05 nm到0.45 nm之間（圖5D），而形成氫鍵的殘基Leu338中RMSF的數(shù)值為0.1 nm，這說明氫鍵起到了限制Leu338的靈活性的作用。

2.6 花青素對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中PTGS2蛋白表達(dá)的影響采用LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞建立神經(jīng)炎癥模型，隨后通過Western blot以及免疫熒光法檢測(cè)花青素對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中PTGS2蛋白表達(dá)的影響。如圖6所示，與空白對(duì)照組相比，LPS組PTGS2蛋白表達(dá)明顯增高，花青素預(yù)處理后明顯降低。

圖6 Western blot和免疫熒光法檢測(cè)PTGS2蛋白的表達(dá)Fig.6 Western blot and immunofluorescence detected expression of PTGS2

3 討論

作為一種由多種因素引起的復(fù)雜疾病，AD的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，而目前用于治療AD的藥物只能在一定程度上緩解AD的癥狀，且治療效果并不理想，副作用嚴(yán)重［6］。花青素是一種常見黃酮類化合物，因其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)保護(hù)作用而備受關(guān)注［7-9］。因此，為了更好探索花青素治療AD的機(jī)制，本課題組通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法對(duì)花青素治療AD的可能作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制進(jìn)行了綜合研究。

通過對(duì)花青素作用靶點(diǎn)與AD疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交集分析，可發(fā)現(xiàn)71個(gè)共同靶點(diǎn)，這提示花青素可能具有抗AD的作用。進(jìn)一步結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，VEGFA、IL-6、SRC、TNF、STAT3、PTGS2以及AKT1等是該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過分析10個(gè)hub基因的富集通路發(fā)現(xiàn)，PTGS2和TNF與AD通路聯(lián)系緊密。PTGS2（即COX-2）是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的酶，可在AD病理生理學(xué)和神經(jīng)退行性變中產(chǎn)生有害作用［30］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，COX-1可在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中組成性表達(dá)，而在病理生理?xiàng)l件下，COX-2在上述細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且COX-2抑制劑在AD、中風(fēng)、帕金森病、多發(fā)性硬化癥和精神分裂癥等疾病的體內(nèi)外模型中均顯示出神經(jīng)保護(hù)作用，這提示COX產(chǎn)物具有神經(jīng)毒性。研究還發(fā)現(xiàn)，COX-2可誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥介導(dǎo)秋水仙堿誘導(dǎo)的AD大鼠模型的記憶損害和神經(jīng)退行性變［31-32］。以上結(jié)果提示抑制COX-2表達(dá)可能在花青素治療AD中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，本研究通過分子對(duì)接技術(shù)以及體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證花青素對(duì)PTGS2的影響。分子對(duì)接結(jié)果顯示，花青素與PTGS2可形成良好結(jié)合，且穩(wěn)定性較好。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，在LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞神經(jīng)炎癥模型中，花青素可顯著降低PTGS2蛋白的表達(dá)，這證明了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，也再次說明PTGS2對(duì)于花青素治療AD的關(guān)鍵性。此外，研究也表明，在AD疾病進(jìn)展過程中，細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6可通過淀粉樣斑塊沉積加重神經(jīng)炎癥過程，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，最終可能導(dǎo)致神經(jīng)元死亡［33］。綜上，花青素可能通過作用于PTGS2、IL-6、TNF等多個(gè)靶點(diǎn)減輕神經(jīng)炎癥，從而對(duì)AD發(fā)揮治療作用。

通過對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，從功能、參與的生物途徑和細(xì)胞中的定位對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行了簡(jiǎn)單注釋。從分子功能富集結(jié)果分析，花青素治療AD主要體現(xiàn)為與各類激酶反應(yīng)；從細(xì)胞組分結(jié)果分析，花青素治療AD的靶點(diǎn)大多集中在膜區(qū)、突觸和軸突區(qū)；從生物進(jìn)程富集結(jié)果分析，花青素治療AD的靶點(diǎn)主要富集在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞參與的各個(gè)反應(yīng)。以上結(jié)果提示花青素可能作用于多細(xì)胞組分參與不同細(xì)胞反應(yīng)過程，從而發(fā)揮治療AD的功效。

淀粉樣斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)是AD的重要病理特征，細(xì)胞外Aβ沉積所引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡等最終可導(dǎo)致神經(jīng)元丟失［34-35］。在本研究中，KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，花青素治療AD可能與PI3K/AKT信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等多條通路密切相關(guān)。PI3K/AKT信號(hào)通路是最重要的信號(hào)通路之一，在多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，PI3K/AKT通路可參與調(diào)控細(xì)胞周期生長(zhǎng)、細(xì)胞遷移、凋亡和自噬等不同的細(xì)胞功能［36-37］。AKT是一種抑制凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵促生存因子，AKT磷酸化可抑制下游促凋亡因子Bax，上調(diào)下游抗凋亡因子Bcl2，最終抑制細(xì)胞凋亡［38］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，天然膳食花色苷（anthocy‐anins）可通過PI3K/AKT/Nrf2/HO-1途徑減輕AD小鼠模型的氧化應(yīng)激、神經(jīng)退行性變和記憶障礙［39］。MAPK是慢性炎癥性疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，多個(gè)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，p38 MAPK能夠協(xié)調(diào)多種與AD相關(guān)的事件，如tau蛋白磷酸化、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)毒性和突觸功能障礙等［40-41］。因此，抑制p38 MAPK被認(rèn)為是治療AD的一種有前景的策略。此外，研究發(fā)現(xiàn)，Rap1信號(hào)通路和Ras信號(hào)通路也與AD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［42］。因此，基于文獻(xiàn)報(bào)道和本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果，預(yù)測(cè)花青素可能通過調(diào)控PI3K/AKT、MAPK等多條信號(hào)通路來抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，減輕神經(jīng)炎癥以及調(diào)節(jié)tau蛋白，從而發(fā)揮治療AD的作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法分析了花青素治療AD的潛在靶點(diǎn)及調(diào)控分子機(jī)制，通過篩選得到71個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，主要涉及PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路等，揭示花青素可能通過減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)tau蛋白等多種途徑來發(fā)揮治療AD的效果，表現(xiàn)出多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)。本研究通過結(jié)合文獻(xiàn)研究、網(wǎng)絡(luò)分析、分子對(duì)接、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對(duì)花青素治療AD的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)和相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行了探索性研究，為花青素治療AD的進(jìn)一步研究及其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。