郭婉怡 袁蓓 張鈮雪 孔祥英 蘇曉 慧林娜（中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700）

關(guān)節(jié)周圍的軟骨破壞和骨質(zhì)侵蝕是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的主要病理特征，也是RA患者致殘的主要原因［1］。約75% RA患者在發(fā)病的頭兩年即發(fā)生骨質(zhì)破壞，60%患者5年內(nèi)會出現(xiàn)不同程度的關(guān)節(jié)畸形及骨質(zhì)侵蝕。一旦骨質(zhì)遭到破壞，則意味著其病理改變進入不可逆期。因此，延緩甚至阻斷骨質(zhì)破壞是RA治療的重要策略之一。

現(xiàn)代研究證明氧化應(yīng)激在RA病情進展中具有重要作用，其中活性氧（reactive oxygen species，ROS）作為氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，大量存在于RA患者的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，通過臨床試驗證實ROS可作為RA患者病情進展的一個潛在標(biāo)記物［2-3］。當(dāng)RA關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)加速，產(chǎn)生ROS超過生理承受能力時，其不僅可以損傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等，而且還能作為重要的內(nèi)源性信號調(diào)節(jié)因子，擴大滑膜炎癥反應(yīng)［4-7］。以往研究證實，ROS對于RA滑膜成纖維細胞的增殖以及炎癥因子的產(chǎn)生有很明顯的促進作用，抑制ROS可以顯著下調(diào)RA滑膜成纖維細胞分泌的炎癥因子IL-1、IL-6和IL-33等［8-9］。然而，ROS與RA骨破壞的關(guān)系如何，ROS能否調(diào)控破骨細胞的形成和分化等相關(guān)問題尚待明確。本文擬通過建立CIA大鼠模型檢測ROS的水平及體外破骨細胞分化體系考察ROS的變化規(guī)律，來揭示ROS與RA骨破壞的關(guān)系，為抗RA骨破壞藥物研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物SPF級雄性C57BL/6小鼠，6~8周齡；SPF級雄性SD大鼠，體重（150±20）g。動物均購于北京華阜康生物科技股份有限公司［許可證號SYXK（京）2015-0041］，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實驗動物中心，日光燈照明，空調(diào)控溫，實驗操作符合中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實驗動物福利倫理審查委員會標(biāo)準(zhǔn)2018-066。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d用于實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器N-乙酰半胱氨酸（N-acetyll-cysteine，NAC）購自英國Abcam公司；α-MEM培養(yǎng)基（貨號：SH30265.01）和優(yōu)質(zhì)胎牛血清（貨號：ST30-3302）購自Gibco公司；Trizol試劑（批號：15596018）購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：K1622）購自美國Thermofisher公司；CTSK（組織蛋白酶K）、MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶9）、TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）、GAPDH（磷酸甘油醛脫氫酶）引物序列由Life Technologies公司合成；RANKL、M-CSF（批號分別為315-11、315-02）購自美國Peprotech公司；2 mg/ml牛Ⅱ型膠原溶液和不完全弗氏佐劑（IFA）（貨號分別為20022、7002）購自Chondrex公司；蘇木精、伊紅染色液（貨號分別為ZLI-9610、ZLI-9613）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Masson三色染色液（貨號：DC0032）購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。全自動酶標(biāo)儀（型號：MK3型）、二氧化碳培養(yǎng)箱（型號371型）和熒光定量PCR儀（型號：ABI7500型）購自Thermofishe公司；低速臺式離心機（型號：TD5A-WS型）購自長沙湘儀離心機儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡（型號：CKX31型）、正置顯微鏡（型號：BX50）購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠CIA模型的建立將16只SD大鼠隨機平分為空白組、CIA模型組，每組8只。建立模型：取適量牛Ⅱ型膠原溶液與等體積的不完全弗氏佐劑（IFA）充分混合乳化，制得濃度為l mg/ml的牛Ⅱ型膠原乳劑；每只大鼠尾根部皮內(nèi)注射0.2 ml。初次免疫7 d后，進行二次免疫，每只大鼠尾根部皮內(nèi)注射0.1 ml。二次免疫后每48 h觀察1次并記錄大鼠四肢發(fā)病狀況?？瞻捉M在相同部位皮內(nèi)注射等量生理鹽水。

1.2.2 動物取材及組織病理切片檢測一免后第30天進行取材，右后肢放在組織固定液中固定72 h，用10%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）脫鈣液脫鈣處理1個月，常規(guī)脫水，石蠟包埋并切片，將切片脫蠟至水，進行HE染色、Masson染色和TRAP染色。鏡下觀察大鼠關(guān)節(jié)炎癥細胞浸潤、滑膜增生、軟骨和骨基質(zhì)破壞及TRAP陽性細胞形成等情況，采集圖像，進行分析。

1.2.3 關(guān)節(jié)組織中ROS生成的檢測將切片常規(guī)脫蠟，經(jīng)抗原修復(fù)、0.1%Triton X-100破膜、0.3%H2O2甲醇溶液抑制內(nèi)源性過氧化物酶處理后，加入DHE-ROS熒光探針，最后DAPI染核3 min并進行封片，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 體外破骨細胞分化模型的建立小鼠脫頸法處死，置于75%酒精中消毒，無菌分離雙側(cè)后肢股骨與脛骨，于超凈臺內(nèi)用PBS洗滌3次，再使骨髓腔充分暴露，用裝有無血清α-MEM培養(yǎng)基的5 ml注射器反復(fù)吹洗骨髓腔至發(fā)白，吹散細胞團進行過濾，后將其吸入15 ml離心管，1 500 r/min離心5 min，棄上清；加入紅細胞裂解液混勻，靜置2 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清；無菌PBS清洗1次，完全培養(yǎng)基重懸細胞進行計數(shù)，最后用含20 ng/ml M-CSF的 培 養(yǎng) 基 稀 釋 細 胞2.5×105個/ml接 種 于24孔板中，每孔1 ml。培養(yǎng)72 h后Control組繼續(xù)使用M-CSF誘導(dǎo)，而RANKL組和給藥組在含M-CSF的基礎(chǔ)上加入RANKL誘導(dǎo)，細胞隔天換液，誘導(dǎo)時間分別為48 h、96 h。

1.2.5 TRAP染色細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的同時給予NAC（給藥劑量1、2.5、5 mmol/L）干預(yù)48 h、96 h后，將貼有細胞的玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定液室溫固定10 min，去離子水洗3次；玻片浸入預(yù)熱到37℃的TRAP染色液，避光溫育1 h；去離子水洗3次；再用蘇木素染色1 min，PBS洗3次；自然干燥，中性樹膠封片；光鏡下觀察拍照，以TRAP陽性多核細胞（細胞核≥3）為破骨細胞。

1.2.6 鬼筆環(huán)肽染色細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的同時給予NAC（給藥劑量1、2.5、5 mmol/L）干預(yù)48 h、96 h后，將貼有細胞的玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定液室溫固定10 min，PBS洗3次，用0.1%Triton X-100細 胞 穿 孔15 min，5%BSA封 閉1 h，PBS洗3次；羅丹明-鬼筆環(huán)肽避光染色30 min，PBS洗3次；再用DAPI染色3 min，PBS洗3次，吸去多余水分，用抗熒光淬滅封片液封片后于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7 RT-PCR檢測細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h、96 h后，PBS漂洗3次，Trizol法提取細胞總mRNA，核酸定量儀檢測RNA濃度。然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性5 min；隨后94℃15 s及60℃30 s，40個循環(huán)，按2-ΔΔCt計算TRAP、MMP-9、CTSK基因相對GAPDH的表達。

1.2.8 免疫熒光染色檢測細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h、96 h后，將貼有細胞的玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定液室溫固定10 min，PBS洗3次，用0.1% Triton X-100細胞穿孔15 min，PBS洗3次，加入相應(yīng)濃度的一抗MMP-9、CTSK，4℃避光孵育過夜；次日PBS洗3次，加入二抗避光孵育1 h，PBS洗3次；羅丹明-鬼筆環(huán)肽避光染色30 min，PBS洗3次；再用DAPI染色3 min，PBS洗3次，吸去多余水分，用抗熒光淬滅封片液封片后于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.9 體外破骨細胞分化中ROS的檢測細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h、96 h后，將貼有細胞的玻片取出，PBS洗3次，在37℃下加入熒光探針DCFH-DA避光孵育30 min，PBS洗3次后抗熒光淬滅封片液封片，于激光掃描共聚焦顯微鏡下拍照，每張玻片隨機取10個位置視野，采用Image J進行熒光陽性細胞熒光強度統(tǒng)計，3個復(fù)孔取均值，結(jié)果以陽性細胞熒光強度/視野表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理Image J軟件對采集圖像進行統(tǒng)計處理，采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIA模型大鼠炎癥關(guān)節(jié)骨破壞情況如圖1A所示，CIA大鼠關(guān)節(jié)紅腫明顯，病程后期紅腫處甚至發(fā)生變形。此外，Masson、HE和TRAP染色結(jié)果顯示，空白組（Control）大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)良好，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，軟骨和軟骨下骨邊界清晰，TRAP陽性染色較淺；而CIA大鼠的Masson染色可見關(guān)節(jié)腔內(nèi)侵入大量纖維化組織，潮線附近有大量火焰狀突起的紅染，軟骨和軟骨下骨邊界不清晰；HE染色可見明顯的炎癥細胞浸潤，滑膜細胞異常增生，軟骨和骨小梁大面積被侵襲；TRAP染色可見軟骨和骨小梁交界處TRAP陽性染色明顯，破骨細胞數(shù)目明顯增多，結(jié)果如圖1B~D。

圖1 CIA模型大鼠炎癥關(guān)節(jié)骨破壞情況Fig.1 Situation about bone destruction of inflammatory joints in CIA model rats

2.2 CIA大鼠關(guān)節(jié)組織中ROS的表達結(jié)果如圖2所示，ROS熒光染色后細胞核呈現(xiàn)藍染，胞中ROS呈現(xiàn)紅染?？瞻捉M關(guān)節(jié)組織ROS熒光強度比較弱，CIA造模后，關(guān)節(jié)骨破壞處表現(xiàn)強ROS陽性染色，即ROS在CIA大鼠關(guān)節(jié)中大量表達。

圖2 DHE熒光探針檢測大鼠關(guān)節(jié)組織ROS的表達（×400）Fig.2 Detection of ROS expression in rat joint by DHE fluorescence probe（×400）

2.3 RANKL誘導(dǎo)48 h和96 h后BMMs向破骨細胞分化情況與單獨M-CSF誘導(dǎo)組相比RANKL誘導(dǎo)組均可見TRAP陽性細胞，其中以96 h組誘導(dǎo)的破骨細胞分化最成熟，細胞體積最大、胞內(nèi)細胞核多，TRAP陽性細胞數(shù)量也多；48 h組誘導(dǎo)的次之，結(jié)果見圖3A。此外，對各組細胞進行鬼筆環(huán)肽染色，M-CSF組未見偽足生成，其余兩組均可見明顯的偽足和褶皺區(qū)，其中以96 h組形成的肌動蛋白環(huán)最明顯，且可見細胞內(nèi)的大量細胞核，結(jié)果見圖3B。

圖3 RANKL體外誘導(dǎo)BMMs向破骨細胞分化形成情況（×200）Fig.3 Induce BMMs into osteoclasts with RANKL in vitro（×200）

2.4 RANKL誘導(dǎo)48 h和96 h后溶骨相關(guān)基因的表達情況如圖4A所示，與M-CSF組相比，48 h、96 h組的TRAP、MMP-9、CTSK mRNA表達均顯著升高，且隨著RANKL誘導(dǎo)時間持續(xù)增強，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。免疫熒光檢測結(jié)果也表明MMP-9、CTSK蛋白在破骨細胞中大量表達，見圖4B。

圖4 體外破骨細胞分化中溶骨相關(guān)活性基因的表達情況Fig.4 Expression of osteoclast specific genes in osteoclast differentiation in vitro

2.5 RANKL誘導(dǎo)48 h和96 h后破骨細胞分化體系中ROS的變化利用DCFH-DA熒光染色檢測細胞內(nèi)原位ROS的表達，如圖5所示。ROS多聚積于肌動蛋白環(huán)處，RANKL誘導(dǎo)48 h、96 h后細胞內(nèi)ROS熒光密度值顯著高于M-CSF組，且呈時間依賴性持續(xù)增強，說明在破骨細胞體外分化過程中ROS表達水平呈逐漸遞增趨勢。

圖5 破骨細胞分化中ROS的變化（×200）Fig.5 Detection of ROS expression in osteoclasts（×200）

2.6 ROS抑制劑NAC對體外RANKL誘導(dǎo)破骨細胞分化的影響在RANKL誘導(dǎo)破骨細胞分化的同時，給予不同濃度的NAC干預(yù)96 h，結(jié)果顯示RANKL組出現(xiàn)大量TRAP陽性多核細胞（核≥3個），鬼筆環(huán)肽染色后RANKL組可見明顯肌動蛋白環(huán)形成，且觀察到細胞內(nèi)的大量細胞核。而給予NAC干預(yù)后明顯抑制了破骨細胞的形成，且中高劑量組未見典型的TRAP陽性細胞形成，與RANKL組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖6。說明ROS介導(dǎo)破骨細胞的分化，抑制ROS產(chǎn)生可明顯抑制破骨細胞分化。

圖6 TRAP和免疫熒光染色法觀察體外破骨細胞分化情況Fig.6 Osteoclast differentiation in vitro was observed by TRAP and immunofluorescence staining

3 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)骨破壞為典型病理特征的慢性、炎癥性、免疫系統(tǒng)性疾病，而破骨細胞的增殖、活化被認為是導(dǎo)致RA骨損傷和骨代謝紊亂的關(guān)鍵因素［10-11］。最近研究表明在RA的發(fā)病和治療過程中，骨破壞與氧化應(yīng)激之間存在密切的相關(guān)性，其中作為氧化損傷重要產(chǎn)物的ROS可能是促進破骨細胞分化的重要物質(zhì)［12］。ROS泛指氧來源的自由基和非自由基，包含了超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH-）、臭氧（O3）和單線態(tài)氧（1O2）等，由于它們含有不成對的電子，因而具有很高的化學(xué)反應(yīng)活性［13］。正常情況下，生理水平的ROS能調(diào)控細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖分化、凋亡等生理活動，而高水平的ROS則破壞氧化還原平衡，可致氧化損傷、功能障礙、疾病甚至細胞死亡［14-15］。也有大量研究表明各種急、慢性炎癥疾病的病理過程都和過量的ROS刺激息息相關(guān)［16-19］。為進一步探索ROS與RA骨破壞的相關(guān)性，本實驗首先通過建立CIA大鼠模型，制作病理切片，采用DHE熒光探針檢測關(guān)節(jié)組織中ROS的表達水平，發(fā)現(xiàn)骨破壞嚴重的炎癥關(guān)節(jié)中的ROS表達顯著上調(diào)，這提示ROS可能參與破骨細胞的分化形成過程。Nrf2是細胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，與野生型小鼠相比Nrf2敲除小鼠顯示骨組織中破骨細胞數(shù)顯著增加，ROS等氧化產(chǎn)物表達增加，抗氧化酶水平降低［20］，這間接反映了ROS參與破骨細胞的形成。為了進一步驗證這一發(fā)現(xiàn)，采用RANKL誘導(dǎo)BMMs向破骨細胞分化建立體外破骨細胞分化模型，免疫熒光染色檢測其分化不同階段（即48 h和96 h）中ROS的變化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROS在這兩個階段中的生成呈趨勢性顯著升高，組間差異顯著，這和動物實驗結(jié)果相符合。TRAP主要反映了破骨細胞的活性及骨吸收能力，是破骨細胞的典型標(biāo)志物；CTSK是一種降解Ⅰ型膠原蛋白的半胱氨酸蛋白酶，參與骨基質(zhì)溶解，與骨量的調(diào)節(jié)密切相關(guān)；MMP-9主要功能是降解或重建細胞外基質(zhì)，參與骨質(zhì)和礦物質(zhì)的降解，是主要的骨溶解性蛋白酶之一。本實驗通過RTPCR法檢測破骨細胞分化中溶骨相關(guān)標(biāo)志性基因TRAP、MMP-9和CTSK，發(fā)現(xiàn)隨著ROS的表達增加，TRAP、MMP-9和CTSK的表達也是逐步增加，兩者的變化趨勢高度吻合，ROS可能貫穿破骨細胞分化的始終。此外，文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)ROS的清除劑諸如脂聯(lián)素、番茄紅素等能明顯抑制ROS等氧化產(chǎn)物的表達來影響破骨細胞骨吸收能力［21-22］。本實驗在RANKL誘導(dǎo)破骨細胞分化的同時，加入ROS經(jīng)典抑制劑NAC干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)NAC以劑量依賴性抑制破骨細胞的形成和分化。因此，ROS可能是誘導(dǎo)破骨細胞分化引發(fā)骨破壞的潛在“催化劑”。

綜上所述，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧ROS在破骨細胞形成和分化過程中起到了不可替代的作用，通過抑制ROS從而抑制破骨細胞的形成和活化為抗RA藥物研發(fā)提供了一個嶄新的方向。本研究結(jié)果有助于將抗氧化應(yīng)激藥物應(yīng)用于RA骨破壞的治療，為擴大抗氧化藥物的適應(yīng)癥提供實驗依據(jù)。