儲(chǔ)貝 孫欽秒（中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥230027）

天然免疫系統(tǒng)作為機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線，在識(shí)別病原體和激發(fā)適應(yīng)性免疫保護(hù)中發(fā)揮重要作用［1］。其免疫識(shí)別的分子機(jī)制是機(jī)體通過模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（pathogen associat‐ed molecular patterns，PAMPs）以及近年提出的損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），激活下游信號(hào)通路，產(chǎn)生促炎癥因子和干擾素，引發(fā)固有免疫應(yīng)答［2-6］。其中，PAMPs是指由病原菌（如LPS）或病毒（如dsRNA/ssRNA/dsDNA/ssDNA）釋放的分子，而DAMPs是指由受損或死亡細(xì)胞釋放的內(nèi)源性分子，如ATP、尿酸晶體及S100蛋白［7］。

目前，已知的PRRs包括膜結(jié)合的Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）和C型凝集素受體（C-typ‐electin receptors，CLRs）；胞質(zhì)中的RIG-Ⅰ樣受體（RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs）、NOD樣受體（NODlike receptors，NLRs）及DNA感 受 器（DNA-depen‐dent activator of IRFs，DAI）等［8-9］。隨著PRRs研究深入，研究者對(duì)于其參加抗病毒應(yīng)答分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)也更為深刻。

cGAS（cyclic GMP-AMP synthase）作為一種重要的胞質(zhì)DNA識(shí)別受體，廣泛存在于哺乳動(dòng)物各種從細(xì)胞。當(dāng)cGAS識(shí)別內(nèi)源或外源的非正常DNA后，自身激活，并將ATP和GTP催化合成cGAMP［10-13］。游離的第二信使分子cGAMP與定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的受體 蛋 白STING（stimulator of interferon genes）結(jié)合［14-15］。激活的STING構(gòu)象發(fā)生改變，形成二聚體并招募下游TBK1激酶（TANK binding kinase 1）、NIK（NF-κB inducing kinase）和異三聚體IKK蛋白，形成龐大的信號(hào)復(fù)合物。其中，TBK1磷酸化下游IRF3（interferon regulatory factor 3）使其形成磷酸化二聚體，轉(zhuǎn)位進(jìn)入核內(nèi)，產(chǎn)生大量Ⅰ型干擾素，激活STING/TBK1/IRF3信號(hào)通路，觸發(fā)抗病毒反應(yīng)［16-17］。

DNA依賴性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）是一種主要定位于核內(nèi)的Ser/Thr激酶［18-19］。DNA-PK是異源三聚體蛋白復(fù)合體，由異源二聚體Ku蛋白和1個(gè)約460 kD的催化亞基DNAPKcs共同組成。其 中，Ku蛋 白由70 kD的Ku70蛋白和80 kD的Ku80蛋白構(gòu)成，該復(fù)合體蛋白在部分生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如固有免疫應(yīng)答、非同源末端連接（NHEJ）、V（D）J重組、細(xì)胞凋亡、端粒維持與細(xì)胞衰老、DNA復(fù)制等［20-21］。

DNA-PK作為重要的胞質(zhì)DNA受體，在抗病毒固有免疫反應(yīng)中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察HEK293T細(xì)胞，內(nèi)源Ku70蛋白定位于細(xì)胞核，DNA刺激時(shí)，Ku70出核靶定于胞質(zhì)并與STING形成復(fù)合體，促進(jìn)固有免疫應(yīng)答反應(yīng)［22］。敲低HEK293細(xì)胞中Ku70蛋白可有效抑制DNA誘導(dǎo)的IFN-λ1激活［23］。此外，成纖維細(xì)胞中，DNA-PK作為胞質(zhì)受體，識(shí)別并結(jié)合牛痘病毒DNA，誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，引發(fā)機(jī)體下游免疫反應(yīng)［24］。但DNA-PK是否參與cGAS/STING/TBK1/IRF3信號(hào)通路和具體調(diào)控機(jī)制尚未明確。

因此，本研究通過免疫共沉淀與質(zhì)譜技術(shù)篩選得到與cGAS結(jié)合的Ku70蛋白，通過蛋白互作實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩者是否存在相互作用。同時(shí)，在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)Ku70，利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)探究Ku70是否參與cGAS介導(dǎo)的信號(hào)通路。敲低THP-1細(xì)胞中Ku70表達(dá)，利用Western blot和qPCR技術(shù)探究Ku70對(duì)cGAS-STING信號(hào)通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系人源HEK293T、THP-1細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫，儲(chǔ)存于液氮罐。參考ATCC數(shù)據(jù)庫，HEK293T培養(yǎng)于DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入適量胎牛血清及雙抗。

1.1.2 主要試劑基礎(chǔ)培養(yǎng)基和雙抗溶液購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000和OPTIMAL-MEM購(gòu)自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自ABM公司；SYBR Green染料購(gòu)自康為公司；顯影發(fā)光底物購(gòu)自Thermo Fisher；Herring testis DNA（HT-DNA）購(gòu)自Sigma；分析化學(xué)試劑（乙醇、甲醇、異丙醇等）購(gòu)自北京化工公司。實(shí)驗(yàn)中所用DNA病毒為HSV-1（Ⅰ型單純皰疹病毒），Vero細(xì)胞擴(kuò)增。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞傳代超凈臺(tái)中棄原有培養(yǎng)基，1×PBS洗去殘留培養(yǎng)基，緩慢加入預(yù)熱胰酶，輕輕搖晃培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱1~2 min，輕輕拍打培養(yǎng)皿使細(xì)胞分散，加入新鮮培養(yǎng)基終止消化。收取細(xì)胞，離心，按適當(dāng)傳代密度轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至預(yù)先加有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，均勻分布于培養(yǎng)皿，移至37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，完成細(xì)胞傳代工作。懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可直接收取細(xì)胞進(jìn)行傳代，無需胰酶消化。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及敲低細(xì)胞系構(gòu)建采用PEI、Li‐pofectamine2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Lipofectamine2000轉(zhuǎn) 染按說明書操作。采用PEI在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)外源目的基因時(shí)，需保證細(xì)胞密度為70%~80%。取1個(gè)1.5 ml EP管加入Opti-MEM及目標(biāo)質(zhì)粒，另取1個(gè)1.5 ml EP管加入Opti-MEM，按質(zhì)粒與PEI質(zhì)量體積比為1∶2加入PEI，混勻2個(gè)EP管中液體，靜置8~10 min。將轉(zhuǎn)染液緩慢加入培養(yǎng)皿中，放回培養(yǎng)箱。PEI毒性較高，轉(zhuǎn)染后6~8 h需及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液。24~48 h后收取細(xì)胞，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

采用RNA干擾技術(shù)沉默靶基因Ku70表達(dá)。設(shè)計(jì)針對(duì)Ku70基因的短發(fā)卡shRNA（靶向核酸序列：GAAGAGTCTACCCGACATAAG），通過慢病毒包裝的形式將shRNA轉(zhuǎn)入THP-1細(xì)胞。由于Plko.1載體中U6啟動(dòng)子可保證shRNA長(zhǎng)時(shí)程表達(dá)，從而篩選出Ku70敲低的THP-1穩(wěn)定細(xì)胞系。

1.2.3 Western blot棄細(xì)胞培養(yǎng)基，1×PBS清洗細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞量加入SDS loading buffer直接裂解細(xì)胞，98℃煮沸。將制備好的蛋白樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育盒中孵育一抗2 h。若目標(biāo)蛋白為內(nèi)源蛋白，則4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入相應(yīng)鼠或兔二抗，繼續(xù)孵育1 h，TBST清洗3次，參照顯影試劑盒說明書配制顯影發(fā)光底物，置于底物溶液中孵育30 s，顯影儀下選擇合適曝光次數(shù)與時(shí)間掃描拍照。

1.2.4 免疫共沉淀采用6 cm培養(yǎng)皿進(jìn)行HEK293T細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，過表達(dá)特定蛋白，研究蛋白相互作用。轉(zhuǎn)染24~48 h后收取細(xì)胞，并用含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心，取少量上清轉(zhuǎn)至新的EP管，加入SDS loading buffer，煮樣，作為Input樣品，檢測(cè)過表達(dá)蛋白表達(dá)。同時(shí)，將剩余上清轉(zhuǎn)至裝有活化beads的EP管，4℃旋轉(zhuǎn)混合儀內(nèi)緩慢搖晃，孵育4~6 h或過夜。清洗3~4次，加入loading buffer，煮樣，作為IP樣品。Input和IP樣品進(jìn)行后續(xù)Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)24孔板中HEK293T細(xì)胞密度達(dá)60%~70%時(shí)，轉(zhuǎn)染一定量Re‐nilla、pGL3-IFN-β-luciferase或pGL3-ISRE-luciferase等質(zhì)粒［25］。轉(zhuǎn)染24 h后，棄培養(yǎng)基，100 μl/孔加入裂解液，冰上裂解細(xì)胞10 min，離心，取20 μl上清依次加至干凈的96孔板，每孔定量加入50 μl Lucifer‐ase assay substrate，輕輕混勻液體，酶標(biāo)儀測(cè)量熒光活性，以Renilla為內(nèi)參，分析數(shù)據(jù)。

1.2.6 qRT-PCR根據(jù)RNA抽提試劑Trizol說明書提取THP-1細(xì)胞總RNA，Nanodrop2000測(cè)定RNA濃度。取2 μg RNA，參照Abm公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，常規(guī)PCR進(jìn)行cDNA合成反應(yīng)。將反轉(zhuǎn)得到的cDNA與反應(yīng)液加至96孔板，Bio-Rad Q-PCR儀中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，t檢驗(yàn)分析差異顯著性，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)Ku70與cGAS存在相互作用

HEK293T細(xì) 胞 中PEI轉(zhuǎn) 染HA-cGAS、HA-STING、Flag-Ku70質(zhì)粒24 h，免疫共沉淀技術(shù)及Western blot分析蛋白相互作用，結(jié)果表明，HEK293T細(xì)胞中，外源過表達(dá)的Ku70蛋白和cGAS蛋白存在較強(qiáng)的相互作用，相反，STING蛋白與Ku70蛋白不存在相互作用（圖1）。

圖1 過表達(dá)Ku70與cGAS相互作用Fig.1 Overexpression of Ku70 interacts with cGAS

2.2 Ku70正向調(diào)控cGAS信號(hào)途徑體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ku70與cGAS有較強(qiáng)的相互作用，提示Ku70蛋白可能參與cGAS介導(dǎo)的抗DNA病毒天然免疫信號(hào)途徑。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HEK293T-STING-stable細(xì)胞中，cGAS表達(dá)顯著激活I(lǐng)FN-β表達(dá)，而Ku70與cGAS共表達(dá)顯著增強(qiáng)cGAS誘導(dǎo)的激活反應(yīng)，且呈劑量依賴性，提示Ku70正向調(diào)控cGAS活性，促進(jìn)cGAS誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素表達(dá)（圖2）。

圖2 過表達(dá)Ku70促進(jìn)cGAS誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素表達(dá)Fig.2 Overexpression of Ku70 enhances cGAS-mediated typeⅠinterferon expression

2.3 Ku70不參與STING介導(dǎo)的信號(hào)途徑探究Ku70是否影響下游接頭蛋白STING活性，在HEK293T細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ISRE報(bào)告基因，結(jié)果顯示，缺少STING的HEK293T細(xì)胞幾乎不表達(dá)ISRE，過表達(dá)STING顯著激活I(lǐng)SRE表達(dá)；Ku70或Ku70與STING共表達(dá)時(shí)，對(duì)STING誘導(dǎo)的ISRE激活無顯著影響，且無劑量依賴關(guān)系，提示Ku70主要調(diào)節(jié)STING上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖3）。

圖3 Ku70過表達(dá)對(duì)STING介導(dǎo)的信號(hào)途徑的影響Fig.3 Effect of Ku70 overexpression on STING-mediated signaling pathway

2.4 敲低Ku70抑制DNA病毒誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生基于cGAS在宿主抵抗DNA免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用，探究Ku70是否影響HSV-1病毒及HT-DNA誘導(dǎo)的天然免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。qPCR數(shù)據(jù)顯示，shRNA有效降低THP-1細(xì)胞中內(nèi)源Ku70表達(dá)，靶向沉默序列有效。同時(shí)，Ku70敲低的THP-1細(xì)胞應(yīng)對(duì)HSV-1感染和HT-DNA刺激時(shí)，與野生型細(xì)胞相比，其誘導(dǎo)的內(nèi)源性IFNB1 mRNA含量明顯降低，表明敲低Ku70抑制宿主抗DNA病毒免疫應(yīng)答（圖4）。

圖4 敲低Ku70抑制宿主抗DNA病毒免疫應(yīng)答Fig.4 Knockdown Ku70 inhibits host immune response against DNA viruses

2.5 干擾Ku70表達(dá)抑制Ⅰ型干擾素信號(hào)通路活化Ku70敲低的穩(wěn)定THP-1細(xì)胞系中，HT-DNA作為刺激物分別處理Plko.1和shKu70細(xì)胞，Western blot結(jié)果表明，HT-DNA刺激后，shKu70細(xì)胞中下游P-IRF3表達(dá)明顯降低，提示Ku70正向調(diào)控宿主抗DNA病毒天然免疫信號(hào)通路（圖5）。

圖5 降低Ku70表達(dá)下調(diào)HT-DNA誘導(dǎo)的IRF3磷酸化水平Fig.5 Ku70 silencing down-regulates phosphorylation levels of IRF3 induced by HT-DNA treatment

3 討論

cGAS是一種重要的胞質(zhì)DNA識(shí)別受體，在抵御外界病原微生物及自身DNA引起的固有免疫應(yīng)答中起重要作用［16，27］。但cGAS抗病毒天然免疫調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，同樣作為胞質(zhì)受體分子的Ku70蛋白與cGAS蛋白存在相互作用，并通過促進(jìn)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生正向調(diào)控cGAS介導(dǎo)的抗DNA病毒天然免疫反應(yīng)。根據(jù)已有研究報(bào)道，當(dāng)識(shí)別病毒DNA后，活化的cGAS催化合成cGAMP，激活STING蛋白，進(jìn)而觸發(fā)cGAS/STING/TBK1/IRF3信號(hào)通路，產(chǎn)生Ⅰ型干擾素的抗病毒反應(yīng)，其中，cGAS識(shí)別并結(jié)合DNA是其發(fā)揮酶活性、激活下游通路所必需的［28］。Ku70能否作為“輔助者”通過促進(jìn)cGAS有效識(shí)別并結(jié)合胞質(zhì)或病毒DNA，進(jìn)而增強(qiáng)cGAS酶活，最終發(fā)揮正向調(diào)控功能。與此同時(shí)，作為異源三聚體蛋白復(fù)合體，DNAPK中另外兩個(gè)成員（DNA-PKcs、Ku80）是否共同參與Ku70調(diào)控cGAS介導(dǎo)的抗病毒免疫應(yīng)答？彼此間是否存在相互促進(jìn)或競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系？實(shí)驗(yàn)證明Ku70與cGAS存在較強(qiáng)的相互作用，這種相互作用是直接作用還是通過某個(gè)支架分子介導(dǎo)間接作用？針對(duì)以上問題，鑒于DNA感受通路影響多個(gè)生理過程和多種疾病，課題組將繼續(xù)深入探尋Ku70在cGAS介導(dǎo)的固有免疫信號(hào)通路中的精細(xì)調(diào)控機(jī)制，為機(jī)體抵御病原體入侵及相關(guān)疾病發(fā)生提供線索及潛在靶標(biāo)。

近年關(guān)于cGAS的研究范圍越來越廣，也讓研究者充分認(rèn)識(shí)到事物的多面性。除參與固有免疫應(yīng)答，Ku70還參與調(diào)控非同源末端連接（NHEJ）、細(xì)胞凋亡、端粒維持與細(xì)胞衰老等［29-30］。與之相對(duì)應(yīng)的cGAS也參與調(diào)控細(xì)胞周期與細(xì)胞衰老，在核內(nèi)抑制同源重組介導(dǎo)的修復(fù)［31-32］。以上生物學(xué)事件中，Ku70與cGAS或許也存在某種特殊的調(diào)控關(guān)系，仍需進(jìn)一步研究。