王元昌，李潔，王玉富，趙信林，邱財生，龍松華，郭媛*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院南方經(jīng)濟(jì)作物研究中心，湖南 長沙 410205;2.中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點實驗室，北京 100101)

由于礦山開采和化肥農(nóng)藥的過量使用，中國農(nóng)田土壤重金屬污染日益嚴(yán)重。據(jù)《2019年中國土壤環(huán)境質(zhì)量報告》農(nóng)用地土壤污染狀況詳查結(jié)果顯示，全國農(nóng)用地土壤環(huán)境狀況總體穩(wěn)定，影響農(nóng)用地土壤環(huán)境質(zhì)量的主要污染物是重金屬，全國土壤重金屬總超標(biāo)率為16.1%，其中中國南方農(nóng)田污染以重金屬為主要污染源[1]。農(nóng)田污染的重金屬元素主要有鉛(Pb)、鎘(Cd)、汞(Hg)和銅(Cu)以及類金屬元素砷(As)，其中Pb和Cd是最主要的重金屬污染物[2]。Cd與As等其他重金屬元素共同造成復(fù)合污染，對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響，造成難以估量的經(jīng)濟(jì)損失[3]。利用經(jīng)濟(jì)作物對重金屬污染農(nóng)田進(jìn)行綠色修復(fù)是一種邊修復(fù)邊利用的比較理想的方法，可以在收獲經(jīng)濟(jì)作物的同時治理污染土壤，同時帶來經(jīng)濟(jì)、社會和環(huán)境效益[4-5]。因此，在重金屬污染地區(qū)種植非食用和非飼用的經(jīng)濟(jì)作物成為產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的方向[6]。

亞麻(Linumusitatissimum.L)具有經(jīng)濟(jì)價值高、耐性強(qiáng)等優(yōu)點。亞麻的主要產(chǎn)品為纖維，除了制作服裝、室內(nèi)裝飾產(chǎn)品外，還可以應(yīng)用于生產(chǎn)建筑復(fù)合材料[7]。植物修復(fù)是一種新型、非入侵性且為公眾所接受的技術(shù)，能夠在可持續(xù)修復(fù)污染土壤的同時生產(chǎn)工業(yè)用原料[8]。研究[9]表明，不同種類的作物在鎘脅迫下所表現(xiàn)出的毒害癥狀差異較大。亞麻因其不進(jìn)入食物鏈、對重金屬脅迫的耐性較強(qiáng)[10]等特點，可作為重金屬污染農(nóng)田植物修復(fù)的潛力作物[11]。

植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是指生活在土壤或附生在植物根圍，對植物生長具有促進(jìn)作用或?qū)Σ≡哂修卓棺饔玫挠幸婢慕y(tǒng)稱，具有固氮、溶磷、解鉀等功能[12]。根際促生菌可以增加ACC 脫氨酶的活性，分解植物在逆境中產(chǎn)生的乙烯合成前體ACC，降低乙烯的濃度，從而緩和植物的不良反應(yīng)。同時，根際促生菌也可以分泌生長素IAA、細(xì)胞分裂素CTK、赤霉素GA等多種植物激素來促進(jìn)植物的生長[13]。研究根際促生菌對亞麻植物生長和富集重金屬的影響，有助于闡明微生物菌根栽培調(diào)控措施與亞麻富集土壤重金屬元素之間的關(guān)系，對利用亞麻進(jìn)行重金屬污染農(nóng)田的修復(fù)具有重要意義[14]。

本研究擬通過盆栽試驗研究4種植物根際促生菌對亞麻植株生長和對土壤中Cd、As富集的影響，以及Cd和As在植株體內(nèi)的富集和轉(zhuǎn)移特征，旨在為利用亞麻進(jìn)行重金屬污染農(nóng)田的修復(fù)及后續(xù)的安全再利用提供理論和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤取自湖南省瀏陽市礦山周圍受重金屬污染的農(nóng)田，經(jīng)測定其總Cd含量為6.34 mg/kg，有效態(tài)Cd含量在2.01～5.05 mg/kg，As含量為462 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量平均為 37.0 g/kg，pH為6.2。根據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)》(GB 15618—2018)，確定該農(nóng)田屬于重度Cd、As復(fù)合污染農(nóng)田。

供試亞麻品種為中亞1號，是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所選育的中早熟纖維用亞麻品種，株高95～105 cm，原莖產(chǎn)量依據(jù)不同產(chǎn)地情況可達(dá)6～11 t/hm2，適合全國絕大部分產(chǎn)區(qū)種植，具有較強(qiáng)的抗倒伏特性。

供試的4種菌劑分別為施菌、產(chǎn)菌、GY16和C5-3。施菌為施氏假單胞菌簡稱，產(chǎn)菌為產(chǎn)朊假絲酵母菌簡稱，GY16為枯草芽孢桿菌簡稱，C5-3為惡臭假單胞菌簡稱。

1.2 試驗方法

將采集回的農(nóng)田土壤樣品進(jìn)行前處理，去除土壤中的大石塊和植物殘體等，然后將土壤風(fēng)干，過2 mm篩。將所有土壤樣品充分混勻后裝盆，盆子直徑25 cm，高30 cm。每盆裝土6.5 kg，播種前先取出一部分土，待將亞麻種子均勻撒在盆內(nèi)后，再將取出的土覆蓋到種子上，播種量為每盆150粒種子。播種前先進(jìn)行菌劑處理，每盆均勻撒10 g泥炭土混合菌劑，出苗后重復(fù)進(jìn)行菌劑處理一次。

收獲后測定每盆亞麻植株的株數(shù)和鮮重，并在每盆中隨機(jī)取10株測定其株高、莖粗和根長。然后將每盆內(nèi)所有亞麻植株分為地下部和地上部兩部分，烘干后分別稱取其干重。生物量測定結(jié)束后，分別將根系與地上部放入紙袋中，于105 ℃烘箱中殺青30 min，75 ℃下烘干至恒重，稱取干重后用不銹鋼粉碎機(jī)粉碎備用。

土壤pH值測定：稱取過100目篩的土樣20 g，放入50 mL的燒杯中，加入去離子水20 mL，以玻璃棒攪拌1 min，使水土充分混合，靜置30 min后用pHS-3C復(fù)合電極測定pH值。土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀氧化法測定。

土壤和植物樣品中重金屬元素測定：土壤樣品風(fēng)干后磨細(xì)過2 mm網(wǎng)篩備用。稱取0.5 g土壤樣品采用HCl-HNO3-HF·H2O-HClO4全消解的方法，用原子吸收分光光度計(Z2310，Hitachi，日本)進(jìn)行全Cd的測定。As含量的測定采用3HCl·HNO3消解，用原子吸收光譜儀(AFS-8230，Titan，中國)測定。土壤有效態(tài)Cd含量采用DTPA浸提-原子吸收分光光度計測定。亞麻植株樣品的Cd含量和As含量通過HNO3-HClO4混合液消煮后采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS(X seriesⅡ))進(jìn)行測定。土壤樣品和植物樣品分別以GB/T 17141—1997和GB/T 5009.15—2003為內(nèi)標(biāo)控制分析質(zhì)量。

富集系數(shù)(bioconcentration factor，BCF)是植物體內(nèi)的重金屬含量與土壤中相應(yīng)重金屬含量的比值，反映植物從土壤中吸收重金屬的能力。其計算公式為:

BCF=植株重金屬含量(mg·kg-1)/土壤重金屬含量(mg·kg-1)

轉(zhuǎn)移系數(shù)(transportation factor，TF)是植物地上部重金屬含量和植物地下部重金屬含量的比值，反映植物吸收重金屬后從根部轉(zhuǎn)移到地上部的能力。其計算公式為:

TF=植株地上部重金屬含量(mg·kg-1)/植株地下部重金屬含量(mg·kg-1)

本試驗以亞麻植株地上部的干重為權(quán)重計算植株地上部的重金屬含量加權(quán)平均值，以此作為亞麻植株地上部的平均重金屬含量，從而計算亞麻地上部的轉(zhuǎn)移系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

文中圖表中的數(shù)據(jù)均為6次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016處理，利用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析，并采用Duncan法在p=0.05顯著水平上進(jìn)行多重比較，最后用Origin 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種根際促生菌接種下亞麻的農(nóng)藝性狀

在產(chǎn)菌、施菌、GY16和C5-3 4種根際促生菌處理下，亞麻植株的株高、根長和莖粗與對照相比均有不同表現(xiàn)，施菌、GY16、C5-3這3種菌處理對亞麻的株高均有增高作用，其中G5-3處理下的株高值最大，增加了7.35 cm；4種菌劑處理下亞麻根長均明顯增長，介于5.68～7.28 cm之間，其中產(chǎn)菌對亞麻根長的促進(jìn)效果最為顯著，增加了2.38 cm；對照和4種菌劑處理后亞麻莖粗介于0.57～0.66 mm之間，對照與各個處理間無顯著性差異。

在產(chǎn)菌、施菌、GY16和C5-3 4種根際促生菌處理下，GY16菌劑處理下亞麻植株干重最大(2.68 g)，且地上部干重與其他處理間有顯著差異。GY16菌劑處理下植株鮮重和株數(shù)指標(biāo)大于其他3種菌劑和對照處理，與對照相比分別增加了9.72 g和1.75株。綜上，GY16菌劑處理能使亞麻植株在株高、莖粗、干重、植株鮮重和株數(shù)等生物學(xué)指標(biāo)上不同程度增加。

表1 4種根際促生菌對亞麻農(nóng)藝性狀的影響Table 1 Effects of fourkinds of rhizosphere promoting bacteria on agronomic characters of flax

2.2 4種根際促生菌處理下亞麻的重金屬富集量

根際促生菌處理下，施菌對亞麻富集Cd有促進(jìn)作用，其與對照相比根系Cd含量增加了3.6 mg/kg。GY16抑制了根部Cd吸收，其與對照相比根系Cd含量降低了5.38 mg/kg。亞麻在4種菌劑處理后，根部As含量均較對照(27.91 mg/kg)升高；除施菌菌劑外，地上部As含量均低于對照(2.92 mg/kg)。由圖1、2可以看出，4種菌劑處理后亞麻根部Cd、As含量均高于莖部，使用施菌菌劑可以促進(jìn)Cd、As在亞麻根系中的積累。

圖1 根際促生菌對亞麻吸附土壤Cd的影響Fig.1 The effect of rhizosphere growth-promoting bacteria on the adsorption of soil Cd by flax

圖2 根際促生菌對亞麻吸附土壤As的影響Fig.2 The effect of rhizosphere growth-promoting bacteria on the absorption of soil As by flax

2.3 不同菌劑處理下亞麻植株地上部和地下部Cd的富集能力與轉(zhuǎn)運特征

由表2可知，在對照和施菌、產(chǎn)菌、GY16和C5-3 4種菌劑的處理下，除GY16地上部干重與對照無顯著差異外，其他處理地上部干重與對照有顯著差異，根部干重各處理與對照無顯著差異。地上部的干重是地下部的2.74～5.87倍。4種菌劑處理下的亞麻地上部Cd富集量顯著低于對照(22.48 mg)，比對照組富集量低6.93～8.35 mg，且各個處理間無顯著差異；亞麻地下部Cd富集量與對照無顯著差異，施菌菌劑處理的地下部Cd富集量最高(40.93 mg)。4種菌劑處理下，地上部重金屬Cd富集系數(shù)均顯著低于對照(3.54)，富集系數(shù)均在2.2以上。在施菌菌劑處理下，亞麻根部Cd富集量最大(40.93 mg)，平均比對照多富集3.60 mg。4種菌劑處理下的轉(zhuǎn)移系數(shù)均低于對照，存在如下規(guī)律：GY16>C5-3>產(chǎn)菌>施菌。

表2 供試亞麻對重金屬Cd的富集和轉(zhuǎn)移特征Table 2 Enrichment and transfer characteristics of heavy metal Cd from flax tested

2.4 不同菌劑處理下亞麻植株地上部和地下部根對As的富集能力與轉(zhuǎn)運特征

由表3可知，4種菌劑處理下亞麻根對重金屬As的富集量均高于對照的27.91 mg，其中施菌處理后根部的富集量最大(79.83 mg)，比對照多吸附51.92 mg，但各個處理之間無明顯差異。除施菌菌劑外，其他處理亞麻地上部重金屬As的富集量均低于對照(2.92 mg)，其中施菌菌劑處理下的重金屬As的富集量最大(5.73 mg)。4種菌劑處理下根部的富集系數(shù)無顯著差異，且地上部富集系數(shù)均低于對照(0.0699)。4種菌劑處理后的轉(zhuǎn)移系數(shù)存在如下規(guī)律：GY16>C5-3>產(chǎn)菌>施菌。

表3 供試亞麻對重金屬As的富集和轉(zhuǎn)移特征Table 3 Enrichment and transfer characteristics of heavy metal As from flax tested

3 討論

研究表明，將根際促生菌應(yīng)用于番茄、水稻、蒲公英和豆科牧草等農(nóng)作物均能促進(jìn)這些作物的生長。采用根際促生菌A25處理番茄可延緩番茄的衰老并提高番茄抵抗逆境的能力[15]；PGPR可以促進(jìn)蒲公英生長和對重金屬鉻的耐性[16]；以根際促生菌各菌株溶磷能力差異篩選豆科牧草，從而獲得溶無機(jī)磷菌株[17]；水稻育秧中加入植物根際促生菌WP8，其出苗率和莖葉干物重均有顯著提升[18]。本研究結(jié)果顯示，根際促生菌GY16可以促進(jìn)重度Cd、As污染土壤中地上部和根的干物質(zhì)積累，說明根際促生菌的加入可提高亞麻在Cd、As污染農(nóng)田種植的生物產(chǎn)量，從而提高其對土壤的修復(fù)效率。一年生韌皮纖維作物如亞麻、紅麻、黃麻和工業(yè)大麻等被用作土壤植物修復(fù)的研究對象，以評估其修復(fù)潛力[19-21]。針對亞麻的研究表明，在中度 Cd 污染土壤中種植亞麻，每公頃可清除最高50 g的Cd，亞麻對Cd的富集量高于工業(yè)大麻[22]，其根系重金屬富集量高于莖稈，與紅麻、水稻等作物有相似特點[23-24]。本研究中，4種根際促生菌處理均能促進(jìn)亞麻根的生長，其中施菌的效果最顯著，并且施菌處理在4種菌劑處理中有更大的生物量。亞麻根系是重金屬吸附的主要器官，且亞麻收獲時一般為帶根收獲，所以將施菌應(yīng)用于亞麻修復(fù)土壤的生產(chǎn)實踐中可以提高其修復(fù)效率。4種菌劑處理下重金屬Cd富集系數(shù)均無顯著差異，地上部的富集系數(shù)均在2.2以上，地下部分的富集系數(shù)均在5以上，4種菌劑處理的地上部轉(zhuǎn)移系數(shù)均低于對照。綜上所述，在植物修復(fù)工程應(yīng)用中，亞麻聯(lián)合施菌的方法對土壤重金屬Cd、As的轉(zhuǎn)移能力最佳。

本研究通過GY16菌劑處理發(fā)現(xiàn)，亞麻植株株高、株數(shù)、莖粗、干重、植株鮮重等生物學(xué)指標(biāo)均有不同程度的提高。施菌菌劑的加入使Cd、As在亞麻根系的富集和轉(zhuǎn)運能力良好，因此在實際生產(chǎn)中，可以將施菌菌劑應(yīng)用于亞麻根部，促進(jìn)其對重金屬Cd、As的修復(fù)效率。在未來大田植物修復(fù)生產(chǎn)實踐中，應(yīng)選擇重金屬抗性較強(qiáng)的亞麻品種，同時加強(qiáng)修復(fù)植物根系微生物的研究，從而提高重金屬污染農(nóng)田的人為植物修復(fù)效率。

4種根際促生菌處理下亞麻植株的Cd、As含量與對照相比雖然有少量增加，但并無顯著差異。這可能是因為盆栽所用的土壤為自然狀態(tài)下的Cd、As污染土壤，未人工添加重金屬元素，土壤中Cd、As含量未達(dá)到亞麻脅迫的閾值，從而導(dǎo)致對照和處理的植株Cd、As含量沒有顯著差異[25]。在未來的大田植物修復(fù)生產(chǎn)實踐中，應(yīng)選擇重金屬抗性較強(qiáng)的亞麻品種，同時加強(qiáng)修復(fù)植物根系的微生物研究，從而提高重金屬污染農(nóng)田的人為植物修復(fù)效率。

本研究通過測定根際促生菌處理下亞麻植株的農(nóng)藝性狀和重金屬的吸附規(guī)律，驗證根際促生菌對亞麻Cd、As富集的影響，但未研究其分子機(jī)制。后續(xù)研究將探討根際促生菌在代謝、轉(zhuǎn)錄和基因組水平上調(diào)節(jié)植物對重金屬脅迫的反應(yīng)機(jī)制，以增強(qiáng)亞麻對Cd、As的耐受性。將16S rDNA序列與GenBank中報道的菌株序列進(jìn)行比較獲得被測菌株的生物學(xué)分類信息[26]，為后續(xù)分子機(jī)制研究提供幫助。由于試驗為盆栽試驗，在人工條件下對亞麻進(jìn)行耐性檢驗，往往與野外實際情況存在差距，可能導(dǎo)致分析出現(xiàn)偏差，如果能延長試驗周期，獲得更加準(zhǔn)確的試驗數(shù)據(jù)，則能更好地指導(dǎo)生產(chǎn)。

4 結(jié)論

(1)在重度Cd、As污染土壤中種植亞麻并施用4種根際促生菌，根系Cd、As含量均高于莖稈，且重金屬含量Cd>As，其地上部對Cd、As的富集和轉(zhuǎn)移系數(shù)均小于1；植株根部Cd、As含量在4種根際促生菌處理后均未表現(xiàn)出顯著差異。

(2)根際促生菌GY16(枯草芽孢桿菌)對重度Cd、As污染土壤中亞麻株高、根長、莖粗、植株鮮重和株數(shù)等指標(biāo)有不同程度的提高，同樣促進(jìn)地上部和根的干物質(zhì)積累，可以將其應(yīng)用于重金屬污染土壤的植物修復(fù)工程。

(3)施菌(施氏假單胞菌)處理的植株，其根部Cd、As富集量較其他菌處理的高，可與GY16混合作為亞麻-根際促生菌聯(lián)合修復(fù)污染土壤的候選菌劑。