郭啟勇，吳心華，陶金忠，郭延生*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)系，寧夏 銀川 750021；2.隴南市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，甘肅 隴南 746000)

【研究意義】奶牛圍產(chǎn)期(Periparturient Period)是指產(chǎn)前21 d和產(chǎn)后21 d[1]。在規(guī)?；?、集約化的生產(chǎn)模式下，圍產(chǎn)期奶牛的營(yíng)養(yǎng)代謝病和產(chǎn)后感染發(fā)病率不斷升高[2]。奶牛在圍產(chǎn)期普遍存在能量負(fù)平衡(Negative energy balance，NEB)[3]，主要原因是圍產(chǎn)前期胎兒的迅速生長(zhǎng)和激素變化導(dǎo)致干物質(zhì)(Dry matter intake，DMI)下降，奶牛分娩結(jié)束后，則迅速進(jìn)入產(chǎn)奶狀態(tài)，由于產(chǎn)犢應(yīng)激，DMI不能盡快恢復(fù)，日糧中的能量不能滿(mǎn)足產(chǎn)奶需要和維持需要[4]。NEB導(dǎo)致奶牛血糖降低，血液中非酯化脂肪酸(NEFA)和β-羥基丁酸(BHBA)濃度升高，使得奶牛圍產(chǎn)期NEB加劇[5]。高濃度的NEFA與BHBA使血液中性粒細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制，增加了奶牛對(duì)外界病原微生物的易感性。奶牛圍產(chǎn)期完成了從妊娠狀態(tài)到分娩再到產(chǎn)后恢復(fù)以及從初乳形成到啟動(dòng)泌乳再到大量泌乳等關(guān)鍵變化。我國(guó)乳業(yè)飛速發(fā)展，規(guī)模化、集約化牧場(chǎng)成為優(yōu)質(zhì)乳品提供者，提高單產(chǎn)和降低發(fā)病率成為規(guī)模化牧場(chǎng)的管理目標(biāo)。【前人研究進(jìn)展】圍產(chǎn)期的各種代謝變化和疾病的發(fā)生都是互相關(guān)聯(lián)的，產(chǎn)后2周內(nèi)是疾病的高發(fā)階段，也是容易淘汰的階段。奶牛產(chǎn)后子宮炎的發(fā)病率大約20%，胎衣不下的發(fā)病率15%～25%[6-7]，免疫抑制影響奶牛的正常代謝，加劇代謝性疾病的發(fā)生。血液是家畜機(jī)體物質(zhì)交換和運(yùn)輸?shù)妮d體，血液生理生化指標(biāo)能夠準(zhǔn)確的反應(yīng)家畜機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝水平、健康狀況和生產(chǎn)性能?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過(guò)對(duì)奶牛產(chǎn)后0、7、14和21 d的血液中肝功、脂代謝等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)產(chǎn)后奶牛的生理生化指標(biāo)及生產(chǎn)性能動(dòng)態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】揭示奶牛產(chǎn)后生理生化動(dòng)態(tài)規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)動(dòng)物均為荷斯坦奶牛，牛只飼喂和樣品采集均于2019年9—11月在寧夏某養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。選取產(chǎn)奶量與體況相近的2～3胎次的產(chǎn)后荷斯坦奶牛10頭。奶牛場(chǎng)每天擠奶3次(4:00，12:00，20:00)。采用全混合日糧(TMR)飼喂，自由飲水，產(chǎn)前用表1配方飼喂，產(chǎn)后用表2配方飼喂。產(chǎn)后1 h內(nèi)將益康XP 350 g、丙酸鈣450 g、硫酸鎂100 g、鹽50 g、丙二醇300 mL、氯化鈣120 g、溫水20 L混合經(jīng)瘤胃液導(dǎo)管灌服。

1.1.2 樣品采集 在分娩后0、7、14、21 d早上飼喂前尾靜脈采集血液10 mL，肝素鈉抗凝，3000 r/min離心10 min，收集血漿，-196 ℃保存。

1.1.3 主要儀器 超低溫冰箱(DW-HL388，中科美菱低溫科技股份有限公司)；Varioskan FlasF全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))；邁瑞獸用全自動(dòng)生化分析儀(BS-180，深圳邁瑞公司)，血酮檢測(cè)儀(Abbott Diabetes，墨西哥)；血糖檢測(cè)儀(雅培，美國(guó))；離心機(jī)(TGL-16，江蘇中大儀器科技有限公司)；移液槍(Eppendorf，所有規(guī)格)等。

1.2 試驗(yàn)方法

血樣常溫下解凍，應(yīng)用邁瑞獸用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)血漿中AST(IFCC法)、ALP(AMP-緩沖液法)、GGT(γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺法)、ALT(連續(xù)監(jiān)測(cè)法)、TP(雙縮脲法)、ALB(溴甲酚綠法)、GLB、LDL-C(選擇性清除法)、HDL-C(過(guò)氧化氫酶清除法)、ApoA1(免疫比濁法)、ApoB(免疫比濁法)、NEFA(酶比色法)、TCH(酶比色法)、TG(氧化酶法)進(jìn)行檢測(cè)；采用ELISA法檢測(cè)血漿中VLDL。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛產(chǎn)后不同階段DMI和產(chǎn)奶量

奶牛產(chǎn)后DMI在0 d顯著低于產(chǎn)后7、14和21 d(P<0.05)，7 d開(kāi)始呈逐漸上升趨勢(shì)(P>0.05)。產(chǎn)奶量在0 d顯著低于產(chǎn)后7、14和21 d(P<0.01)，產(chǎn)后7 d產(chǎn)奶量顯著高于產(chǎn)后21 d(P<0.05，表1)。

表1 奶牛產(chǎn)后DMI和產(chǎn)奶性能的變化

2.2 奶牛產(chǎn)后肝功相關(guān)生化指標(biāo)變化規(guī)律

血漿中AST、GGT在0 d顯著低于其他各時(shí)間段(P<0.05，表2)，血漿中AST在0～7 d上升顯著(P<0.05)，在14～21 d上升顯著(P<0.05)；血漿中ALP在0 d顯著高于其他各組(P<0.05)；血漿中ALT隨時(shí)間呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)(P>0.05)；血漿中TP在21 d顯著高于其他時(shí)間段(P<0.05)；血漿中ALB個(gè)時(shí)間段差異不顯著(P>0.05)；血漿中GLB在7 d顯著高于其他時(shí)間段(P<0.05)；血漿中VLDL呈逐漸下降趨勢(shì)且21 d顯著低于7 d(P<0.05)。

表2 奶牛產(chǎn)后肝功能相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

2.3 奶牛產(chǎn)后脂代謝相關(guān)生化指標(biāo)變化規(guī)律

血漿中BHBA在14 d極顯著高于其他組(P<0.01，表3)；血漿LDL-C在7 d顯著高于其他時(shí)間段(P<0.05)；血漿中HDL-C在0 d顯著低于其他時(shí)間段(P<0.05)，隨時(shí)間呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(P>0.05)；血漿中ApoA1在14 d顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)；血漿中ApoB在0 d顯著低于其他時(shí)間段(P<0.01)；血漿中NEFA 在14 d極顯著低于其他時(shí)間段(P<0.01)；血漿中TCH在14 d顯著高于其他各時(shí)間段(P<0.05)，在7 d具有上升趨勢(shì)(P> 0.05)；血漿TG、GLu在0 d顯著高于其他時(shí)間段(P<0.05)；血漿中GLu在7 d開(kāi)始有緩慢上升趨勢(shì)(P>0.05)。

表3 奶牛產(chǎn)后脂代謝相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

3 討 論

3.1 奶牛產(chǎn)后血糖變化規(guī)律

血漿中GLu濃度作為評(píng)價(jià)機(jī)體代謝最為普遍的標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)血漿中GLu濃度反應(yīng)糖代謝水平[8]，血漿中GLu是通過(guò)糖異生維持。GLu在機(jī)體中的代謝由神經(jīng)內(nèi)分泌激素調(diào)控，常見(jiàn)的有胰島素、胰高血糖素、腎上腺素、糖皮質(zhì)激素、生長(zhǎng)激素等。在本次研究中，產(chǎn)后0 d的血糖水平極顯著于其他各時(shí)間段。在生產(chǎn)應(yīng)激作用下，GLu迅速升高。這與之前的研究一致[9]。在圍產(chǎn)期，奶牛存在低血糖。奶牛血漿中GLu低于2.8 mmol/L在臨床上判定為低血糖[10]。隨著采食量的不斷提高，奶牛的血漿中GLu在產(chǎn)后14 d逐漸恢復(fù)，在圍產(chǎn)前期奶牛需要大量的GLu供給來(lái)滿(mǎn)足胎兒的營(yíng)養(yǎng)需要[11]。奶牛產(chǎn)后產(chǎn)奶性能的恢復(fù)和DMI不能迅速提高而導(dǎo)致的低血糖。在圍產(chǎn)后期，乳腺需要大量的GLu來(lái)合成乳汁，造成嚴(yán)重NEB。GLu降低還會(huì)影響肝臟清除極低密度脂蛋白的能力，極低密度脂蛋白從肝中運(yùn)送受阻，TG在肝中蓄積導(dǎo)致奶牛的脂肪肝。

3.2 奶牛產(chǎn)后肝功能的代謝變化

肝臟是反芻動(dòng)物極為重要的代謝器官，各種酶含量豐富，體內(nèi)多種生理生化反應(yīng)必須在肝臟的參與下才可以完成。圍產(chǎn)期肝臟的代謝活躍。臨床上通常使用AST、ALT、ALP和GGT來(lái)評(píng)價(jià)肝臟的功能和代謝狀況[12]。ALT 和AST主要反應(yīng)肝實(shí)質(zhì)的損害，ALT主要存在于肝細(xì)胞中，在血漿中相對(duì)較少，1%肝細(xì)胞死亡，則血清中的酶活性增加1倍，AST、GGT產(chǎn)后0 d顯著低于產(chǎn)后7、14和21 d，產(chǎn)后血漿中AST的濃度在不斷增加，產(chǎn)后癱瘓、酮病、乳房炎都可以檢測(cè)到AST濃度升高[13]，AST的濃度升高與疾病有關(guān)。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，血液中的ALT和AST的濃度增高。研究顯示當(dāng)奶牛血漿中AST>100 U/L，奶牛存在發(fā)生脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)[14]。GGT主要存在于家畜的腎臟及奶牛乳腺中，GGT存在于腺體上皮，其活性可能與氨基酸代謝強(qiáng)度有關(guān)[15]。奶牛產(chǎn)后，血漿中GGT的濃度隨之升高，肝臟的代謝紊亂會(huì)加劇血液中GGT濃度的升高。說(shuō)明奶牛產(chǎn)后存在肝臟損傷，有患脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)。

圍產(chǎn)期奶牛蛋白質(zhì)的變化規(guī)律可以通過(guò)分析TP、ALB的濃度來(lái)確定。TP和ALB反應(yīng)蛋白質(zhì)的缺乏與代謝。奶牛體內(nèi)ALB在肝臟內(nèi)合成，ALB降低說(shuō)明肝臟合成蛋白的能力下降，TP主要反應(yīng)肝臟對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解和儲(chǔ)備能力，有研究表明，TP的正常含量是(65.85±15.82)g/L，白蛋白(24.53±4.27)g/L[16]。本研究中，血漿中TP在產(chǎn)后21 d顯著高于其他時(shí)間段，與奶牛泌乳期一致，在產(chǎn)后逐漸升高，說(shuō)明泌乳需求的啟動(dòng)和DMI的逐漸恢復(fù)，使得血漿中的TP逐漸增高。VLDL在肝臟由TG和TCH合成，本研究中，TG在產(chǎn)后0 d顯著高于其他時(shí)間段，說(shuō)明產(chǎn)犢初期奶牛PRL的濃度升高，PRL濃度的升高則會(huì)抑制脂蛋白連接酶的活性，促使體內(nèi)TG濃度增加。從肝臟釋放的富含甘油三酯的VLDL轉(zhuǎn)化為富含TCH的低密度脂蛋白，由全身特定的細(xì)胞膜受體分解代謝。奶牛肝臟脂肪主要以VLDL形式轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟[17]，本研究中，產(chǎn)后0 d顯著高于其他時(shí)間段，說(shuō)明奶牛產(chǎn)后0 d肝臟脂肪輸送能力優(yōu)于產(chǎn)后21 d。有研究顯示，高產(chǎn)奶牛的VLDL濃度高于低產(chǎn)奶牛，高產(chǎn)奶牛在熱應(yīng)激條件下，血漿中VLDL的濃度為(0.76±0.04)mmol/L[18]，這與產(chǎn)后21 d血漿中的VLDL一致，說(shuō)明奶牛在圍產(chǎn)后期的脂肪肝與肝臟輸送TG的能力有關(guān)。

3.3 奶牛產(chǎn)后脂質(zhì)代謝變化

脂質(zhì)不溶于血漿，并且無(wú)法遞送到腎上腺、性腺等組織。圍產(chǎn)后期，奶牛由于產(chǎn)奶需要，對(duì)乳脂、乳糖的需求急速上升，對(duì)日糧中葡萄糖的需求也增多[19]。圍產(chǎn)期奶牛DMI下降，使葡萄糖不能滿(mǎn)足奶牛生產(chǎn)需要，此時(shí)就會(huì)發(fā)生脂肪動(dòng)員，脂肪動(dòng)員釋放大量的NEFA進(jìn)入血液及肝臟，引起營(yíng)養(yǎng)代謝病。奶牛在產(chǎn)后1個(gè)月內(nèi)，約有5%～10%的奶?；加兄囟戎靖?，30%～40%的奶牛患有中度脂肪肝，脂肪肝除了導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降，還會(huì)提高其他感染性疾病的發(fā)病率[20]。體脂代謝產(chǎn)生大量NEFA可以作為β-氧化的能量燃料。高濃度的NEFA會(huì)損傷細(xì)胞線(xiàn)粒體的功能，降低ATP的產(chǎn)量[21]。對(duì)不能進(jìn)行β-氧化的組織(例如神經(jīng)元組織)，肝臟產(chǎn)生BHBA替代葡萄糖為機(jī)體供能。盡管BHBA和NEFA是重要的代謝能源，但高濃度的BHBA和NEFA會(huì)導(dǎo)致代謝障礙，增加酮病和脂肪肝的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[22]。由于NEFA升高導(dǎo)致肝臟脂肪變性，引起VLDL的合成減少，導(dǎo)致NEFA濃度在產(chǎn)后0 d顯著高于其他時(shí)間。肝臟中過(guò)量的NEFA沒(méi)有被及時(shí)清除，蓄積之后生成BHBA[23]。根據(jù)本研究表示，奶牛產(chǎn)后14 d血漿中BHBA顯著高于其他時(shí)間段，存在患酮病的風(fēng)險(xiǎn)，BHBA值的升高與采食量的下降也有關(guān)系，奶牛的采食量在產(chǎn)后14 d并沒(méi)有恢復(fù)。能量負(fù)平衡導(dǎo)致機(jī)體進(jìn)行脂肪動(dòng)員，機(jī)體需要分解大量的NEFA為機(jī)體提供能量[24]。當(dāng)機(jī)體無(wú)法全部利用NEFA時(shí)，就會(huì)引發(fā)酮病。過(guò)量的NEFA進(jìn)入線(xiàn)粒體β-氧化或重新脂化生成TG，TG蓄積在肝臟，與膽固醇脂、磷脂和ApoB形成極低密度脂蛋白，極低密度脂蛋白進(jìn)入血液循環(huán)之后會(huì)形成低密度脂蛋白[25]。

NEFA在脂酰輔酶A合成酶的作用下轉(zhuǎn)化為脂酰輔酶A，代謝分為三個(gè)途徑，一是徹底氧化成CO2所產(chǎn)生的能量被肝臟利用，二是部分生成BHBA，被肝臟之外的組織利用；三是脂化成甘油三酯、磷脂和膽固醇脂，轉(zhuǎn)移到乳腺，合成乳脂[26]，反芻動(dòng)物生成甘油三酯的脂肪酸主要來(lái)自于血液中的NEFA。肝臟中的甘油三酯可以通過(guò)極低密度脂蛋白轉(zhuǎn)移出肝臟，為外周組織所利用。反芻動(dòng)物體內(nèi)缺乏脂蛋白脂酶和肝脂酶[27]。奶牛產(chǎn)后0 d血漿中TG顯著高于其他時(shí)間段，說(shuō)明奶牛肝臟中蓄積大量的TG，與圍產(chǎn)前期飼喂偏胖有關(guān)，奶牛干奶期間肥胖加劇了奶牛產(chǎn)后低血糖的發(fā)生和產(chǎn)后DMI的降低。奶牛產(chǎn)后由于體脂動(dòng)員和內(nèi)分泌機(jī)能的改變，DMI下降使乳腺需要的營(yíng)養(yǎng)得不到滿(mǎn)足，從而導(dǎo)致脂肪的動(dòng)員，血液中的NEFA濃度急劇增加，并通過(guò)血液進(jìn)入其他組織，從而加重奶牛的NEB。

ApoA1是HDL-C的主要結(jié)構(gòu)蛋白，ApoB是LDL-C的主要結(jié)構(gòu)蛋白，ApoB是肝臟中VLDL組裝所必需的，作用于LDL受體的配體可用于從血液中清除LDL顆粒，有助于從腸道吸收膳食脂肪，為肝臟中VLDL組裝所必需，并且還充當(dāng)LDL受體藥物從血液中清除LDL顆粒的主要配體。載脂蛋白B的主要功能是參與低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白的組裝和分泌，是脂蛋白和特異性受體的主要連接物[28]。奶牛產(chǎn)后7 d血漿中HDL-C、LDL-C、ApoA1、ApoB顯著高于其他時(shí)間段，可能是因?yàn)楫a(chǎn)后7 d泌乳機(jī)能啟動(dòng)導(dǎo)致。泌乳機(jī)能的啟動(dòng)會(huì)導(dǎo)致血漿中HDL-C、LDL-C、ApoA1、ApoB濃度升高，可能與產(chǎn)后灌服丙二醇有關(guān)[29]，說(shuō)明圍產(chǎn)期奶牛的脂肪代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致肝臟運(yùn)輸障礙，從而導(dǎo)致代謝性疾病的多發(fā)。脂蛋白運(yùn)輸發(fā)生障礙，會(huì)蓄積在肝臟，影響肝臟的正常代謝功能。BHBA蓄積會(huì)導(dǎo)致體脂代謝謝異常，但NEFA濃度已經(jīng)降低，說(shuō)明產(chǎn)后奶牛肝臟對(duì)物質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)化能力沒(méi)有恢復(fù)，仍然處于嚴(yán)重的NEB狀態(tài)。

4 結(jié) 論

隨著產(chǎn)后14 d干物質(zhì)采食量的逐漸恢復(fù)，血糖開(kāi)始逐漸正常。奶牛產(chǎn)后處于能量負(fù)平衡階段，肝臟和脂肪代謝發(fā)生異常，從而導(dǎo)致各種代謝性和感染性疾病的發(fā)生。