廖興剛，胡明瑜，孟澤彬，羅 倩，白文欽

(1.貴州師范學(xué)院 貴州省茶籽資源綜合開發(fā)利用工程研究中心，貴州 貴陽 550018；2.重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究中心，重慶 401329)

【研究意義】昆蟲病原真菌是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中多種害蟲的寄生性天敵，其中已被廣泛研究的綠僵菌(Metarhiziumspp.)和白僵菌(Beauveriaspp.)有著巨大的生物防治潛力，可應(yīng)用于防治多種農(nóng)、林業(yè)害蟲[1]。近20年有關(guān)昆蟲病原真菌致病機理的研究取得長足進步，通過生物工程技術(shù)遺傳改良獲得了高毒力致病菌株[2]。然而，由于昆蟲病原真菌開發(fā)的真菌殺蟲劑存在擊倒害蟲速度緩慢、防效不穩(wěn)定，公眾對轉(zhuǎn)基因生物安全存在疑慮等因素，致使商業(yè)化真菌制劑產(chǎn)品并未得到大規(guī)模應(yīng)用[3]。部分昆蟲病原真菌如金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)與球孢白僵菌(Beauveriabassiana)具“兩型性”生活史，即營寄生生活與營腐生生活[4]。長久以來人們主要關(guān)注昆蟲病原真菌的侵染致病機理，即對營寄生生活進行了深入研究，而忽視了對營腐生生活的探究。對昆蟲病原真菌不同生活史的片面研究導(dǎo)致對該類真菌認知的局限性。因此，只有了解昆蟲病原真菌完整的生活史以及不同生活史轉(zhuǎn)換的機制，才能更好、更充分的利用該類真菌進行生防制劑的開發(fā)應(yīng)用?！厩叭搜芯窟M展】近幾年來，金龜子綠僵菌與昆蟲及植物宿主互作關(guān)系的相關(guān)研究已成為昆蟲病原真菌開發(fā)應(yīng)用研究領(lǐng)域的新方向。目前，已初步探明金龜子綠僵菌能定殖于植物根部[5]，利用植物根部分泌的蔗糖和棉籽糖等多糖類碳源物質(zhì)營腐生生活[6-7]。在與宿主植物共生期間，金龜子綠僵菌可保護宿主植物，如殺死取食根部的害蟲并轉(zhuǎn)移氮素給植株以維系自身的養(yǎng)分來源[8]，或通過分泌植物發(fā)育必需的某些生長激素(如IAA)激活植物免疫系統(tǒng)，提高對病蟲害的防御等途徑促進宿主植物的生長[9]。在無化肥、農(nóng)藥施用的試驗田，采用孢子包裹種子方式施用某些綠僵菌菌株能夠促進小麥、玉米在田間的生長并提高其產(chǎn)量，證明綠僵菌具有作為生物肥料促進作物生長的潛在優(yōu)勢[10]。相關(guān)研究為開發(fā)兼具殺蟲與植物生長增效作用的昆蟲病原真菌制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用提供了新方向?！颈狙芯壳腥朦c】目前對綠僵菌營腐生生活機理雖有一定的研究，但對該類真菌在根際土壤中與宿主植物的互惠互作了解較少。從不同綠僵菌菌株在玉米根部定殖及對玉米生長的影響方面，探究不同來源(寄主、地域)的綠僵菌定殖植物根部的種間特異性，篩選能顯著促進宿主植物生長的綠僵菌菌種的研究尚未見相關(guān)報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在已有研究基礎(chǔ)上，以貴州省主要糧食作物玉米為材料，比較不同來源、種屬的綠僵菌菌株在植株根部的定殖和促進植株生長能力，初步探明其營腐生生活階段的種間特異性，旨在篩選能促進宿主玉米植株生長的優(yōu)異菌株，為進一步開發(fā)兼具殺蟲與植物生長增效于一體的新型真菌殺蟲劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 真菌菌株 測試綠僵菌菌株均由美國馬里蘭大學(xué)昆蟲系(Department of Entomology，University of Maryland，College Park)饋贈。菌株來源詳見表1，所有菌株均經(jīng)單孢分離，用PDA培養(yǎng)基在26 ℃培養(yǎng)14 d，備用。

表1 測試菌株信息

1.1.2 植物 玉米品種為黔單10號，是貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所選育的適宜西南肥水條件較好區(qū)域種植的國審品種(國審玉20000015)，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供。

1.1.3 試劑 0.05% Tween 80，西寶生物(中國)；Gum Arabic阿拉伯膠，Sigma-Aldrich(USA)；Rose-bengal selective agar medium綠僵菌篩選培養(yǎng)基，Sigma-Aldrich(USA)。

1.1.4 儀器與設(shè)備 土陶盆(35 cm×40 cm)；SPAD 502 Plus葉綠素測定儀，Konica Minolta Sensing，Inc.(Japan)。

1.1.5 其他 玉米栽培用土取自重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田，為西南山區(qū)丘陵地帶常見黃壤土，經(jīng)121 ℃滅菌處理后備用。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理 將綠僵菌孢子懸浮于體積分數(shù)為0.05%的Tween 80分散劑中，獲得濃度為5×108個/mL的孢子懸浮液。在孢懸液中加入阿拉伯膠至終濃度為10%，使孢懸液趨于粘稠。

1.2.2 試驗設(shè)計 根據(jù)菌株種類試驗設(shè)10個處理(表1)，每種菌株處理8粒種子，即每處理8次重復(fù)。選取籽粒飽滿健康的玉米種子，用微量移液器取20 μL孢子懸浮液滴至種子一面的胚乳表皮上，處理種子置于干燥通風(fēng)處晾干3～5 h至孢子緊密粘附于玉米種子表面。采用同樣方法處理玉米種子另一面，確保種子兩面均吸附等量的真菌孢子。將各菌株孢懸液等比例混合經(jīng)121 ℃滅菌后按同樣方法處理種子作為對照(CK)。處理后的種子于第2天進行播種。

1.2.3 玉米播種與管理 采用盆栽種植玉米，于2016年7—8月在重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗基地進行。用土陶盆裝入適量土壤，按每缽1粒進行播種，播種深度5 cm左右。盆栽玉米置室外生長1個月。植株生長期間不施肥，不施用任何殺蟲劑和殺菌劑，定期澆水避免土壤板結(jié)。

1.2.4 真菌根部定殖測定 播種后1、2和4周，對照與每個真菌處理隨機選取3株植株，使用芯型土壤取樣器從離玉米主根1 cm附近鉆取約0.5 g土壤，用0.05% Tween 80分散劑懸浮土樣，充分振蕩渦旋使土樣中的真菌分散至溶液中。取100 μL土樣懸浮液涂布于綠僵菌篩選培養(yǎng)平板，每個土樣重復(fù)3個平板，于26 ℃培養(yǎng)10 d后計數(shù)平板上菌落數(shù)。計算每個土樣中的菌落形成單位(cfu)，即得到每克根際土壤中的真菌數(shù)量(cfu/g)。

1.2.5 植株生長測定 課題組前期試驗結(jié)果表明，羅伯茨綠僵菌(Mr23)與金龜子綠僵菌(Mr2575)對多種單、雙子葉植物如小麥、玉米、花生及擬南芥的種子萌發(fā)均無影響?；诖耍狙芯咳?0顆經(jīng)真菌處理的玉米種子播種于小型塑料盆缽中，5 d后測定種子的發(fā)芽率，4次重復(fù)。葉領(lǐng)形成計數(shù)法(Leaf Collar Method)是利用葉片分化生長情況確定玉米植株生長階段的做法[11]，通過在特定時間(處理2周和4周)計數(shù)每株玉米葉領(lǐng)數(shù)量監(jiān)測玉米葉齡的形成。處理1周、2周、3周和4周后定期測定植株莖稈高度作為植株莖稈生長指標。葉片葉綠素形成(含量)，處理1周、2周、3周和4周后采用手持式SPAD 502 Plus葉綠素測定儀測定新生葉片葉綠素含量，每株取靠近植株頂端兩片葉片中部進行測量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 22進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同綠僵菌菌株在玉米根際土壤中的定殖能力

根際土壤中真菌的種群數(shù)量可以反映其在植物根部的定殖能力。從圖1看出，不同檢測時期各測試綠僵菌菌株均能定殖于玉米根部，但不同種屬綠僵菌菌株間的定殖能力存在差異；隨著共生時間延長，各菌株在玉米根際土壤中的群體數(shù)量呈下降趨勢；對照組在根際土壤中基本檢測不到綠僵菌。不同檢測時期(播種后1、2和4周)，菌株Mac324定殖玉米根部能力均顯著低于其他菌株，根際群體數(shù)量始終最低。播種后第1周，各菌株在根際土壤中的群體數(shù)量為2166～4530 cfu/g，依次為Ma939>Mb2974>Mr2575>Ma932>Mr23>Ma808>Mb820>Mr1046>Mb1187>Mac324。其中，菌株Mb1187顯著低于除菌株Mr1046外的其余處理。播種后第2周，各菌株在根際土壤中的種群數(shù)量為1384～3466 cfu/g，依次為Mr23>Mb820>Ma932>Ma939>Mr2575>Ma808>Mb2974>Mr1046>Mb1187>Mac324。其中，菌株Mb1187的定殖能力顯著低于除Mr1046、Ma808和Mb2974外的其余菌株。播種后第4周，各菌株在根際土壤中的種群數(shù)量為686～2595 cfu/g，依次為Ma932>Mr2575>Ma808>Mr1046>Mb820>Mr23>Ma939>Mb2974>Mb1187>Mac324。其中，菌株Mb1187的定殖能力顯著低于Ma932和Mr2575，與其余菌株差異不顯著。

不同種屬綠僵菌菌株間，如M.acridum(Mac324)菌株與M.anisopliae(Ma808、Ma932和Ma939)、M.brunneum(Mb820、Mb1187和Mb2974)及M.robertsii(Mr2575、Mr23和Mr1046)菌株間種群數(shù)量存在顯著差異；同一種屬菌株如Mb1187與Mb820、Mb2974間的種群數(shù)量也存在一定差異。

2.2 不同綠僵菌菌株對玉米生長的增效效應(yīng)

2.2.1 玉米種子的萌發(fā)率 某些根系微生物能促進宿主種子的萌發(fā)。從圖2看出，各菌株處理玉米種子的萌發(fā)率為92.5%～96.3%，依次為Mr1046=Ma939=Mb820>Mr23=Ma808=Ma932=Mac324>Mr2575=Mb1187>Mb2974，但均與CK差異不顯著，說明綠僵菌對玉米種子的萌發(fā)沒有促進作用。推測綠僵菌只有在根部定殖后才能與宿主植株形成互惠共生關(guān)系。

2.2.2 玉米的營養(yǎng)生長 從圖3看出，不同生長時期綠僵菌對玉米葉片和莖稈生長的影響。

(1)葉片。在玉米播種后第2周，各處理玉米葉領(lǐng)數(shù)為2.1～3.0片，依次為Mb820=Mr2575(3.0片)>Ma939=Mr23=Ma808(2.9片)>Mb2974=Ma932=Mr1046(2.8片)>Mb1187(2.6片)>Mac324(2.1片)，較CK(2.1片)提高0%～42.8%，除菌株Mac324外其余菌株對玉米葉片生長均有促進作用，但菌株處理間的增效無顯著差異；播種后第4周，玉米葉領(lǐng)數(shù)為5.6～6.6片，依次為Mb820=Ma939=Mr23=Mr2575=Mb2974(6.6片)>Ma808(6.5片)>Ma932(6.4片)>Mr1046(6.3片)>Mb1187(6.1片)>Mac324(5.6片)，較CK(5.6片)提高0%～17.8%。其中，菌株Mb1187、Mac324的玉米葉片生長與CK差異不顯著，其余處理均顯著高于對照，菌株處理間的增效同樣無顯著差異。

(2)莖稈。在玉米幼苗生長初期(播種后第1～2周)，所有菌株對玉米幼苗莖稈生長無影響。第1周，各處理玉米莖稈高度為2.9～3.2 cm；第2周，玉米莖稈高度為19.1～21.1 cm；所有菌株處理與CK無顯著差異。在幼苗生長中期(播種后第3周)，玉米莖稈高度為39.5～46.5 cm，依次為Mr23(46.5 cm)>Mr2575(45.4 cm)>Mb2974(45.1 cm)>Mb820(44.5 cm)>Ma932(44.2 cm)>Ma808(43.9 cm)>Ma939(43.2 cm)>Mr1046(42.1 cm)>Mb1187(40.0 cm)>Mac324(39.5 cm)，其中，菌株Mb1187與Mac324對幼苗莖稈生長基本無影響，較CK(40.3 cm)下降0.74%～2.0%，與CK差異不顯著；其余菌株較CK提高4.47%～15.4%，均顯著促進幼苗莖稈生長。至幼苗生長后期(播種后第4周)，各處理玉米莖稈高度為67.1～78.2 cm，依次為Mr23(78.2 cm)>Ma932(75.1 cm)>Mb2974(74.9 cm)>Ma939(74.7 cm)>Mr2575(74.2 cm)>Mb1187(73.4 cm)>Mb820(73.0 cm)>Ma808(72.5 cm)>Mr1046(68.4 cm)>Mac324(67.1 cm)，Mac324較CK(67.6 cm)下降0.74%，其余處理較CK提高1.18%～15.70%。其中，菌株Mr1046與Mac324處理的玉米幼苗莖稈生長均與CK差異不顯著，其余菌株均顯著促進幼苗莖稈生長。

2.2.3 玉米葉片的葉綠素含量 葉片葉綠素形成對植物光合作用至關(guān)重要，影響光合作用第一階段也就是光反應(yīng)階段。植物的葉綠素含量與光合速率成正相關(guān)，光合作用強的植株最終產(chǎn)出的生物量增多。因此，檢測真菌處理的玉米葉片中的葉綠素形成有助于了解綠僵菌是否通過促進玉米的葉綠素合成提高宿主植株的生物量產(chǎn)出。從圖4看出，播種后第1周，各處理玉米葉片的葉綠素含量為34.39～36.94 SPAD，CK為34.73 SPAD；播種后第2周，葉綠素含量為40.25～43.37 SPAD，CK為40.86 SPAD；播種后第3周，葉綠素含量為48.95～52.24 SPAD，CK為48.62 SPAD；播種后第4周，葉綠素含量為52.00～54.44 SPAD，CK為52.46 SPAD。表明，隨著生長期的延長，各處理玉米葉片葉綠素含量均呈上升趨勢，但在玉米不同生長時期(1～4周)各處理玉米葉片葉綠素含量與當期CK均無顯著差異。說明，綠僵菌定殖玉米根部不影響宿主植物的葉綠素合成。

3 討 論

供試菌株除Mr2575、Mr23、Ma939與Mb820外，其余菌株尚未見能定殖于植物根部的研究報道。該研究所有測試菌株均能定殖于玉米根部，但菌株Mac324與Mb1187的定殖能力較弱，暗示了綠僵菌屬真菌在植物根部營腐生生活的普遍性。M.acridum種是一類專化性極強的綠僵菌菌株，主要侵染寄生蝗蟲。在土壤中很少分離得到?；詮姷睦ハx病原真菌，包括綠僵菌與白僵菌菌株。因此，推測?；詮姷木旰茈y在土壤中存活[12]。該研究結(jié)果也證實了菌株Mac324的根部定殖能力顯著低于其他菌株，推測隨著釋放真菌在土壤中循環(huán)周期的延長，其最終可能在植物根部甚至土壤中消失。M.brunneum種綠僵菌在土壤中存在較多，但研究發(fā)現(xiàn)，菌株Mb1187的根部定殖能力較弱，可能與該類綠僵菌在土壤中偏好性地與草類互惠共生有關(guān)[13]；但其余2株M.brunneum菌株Mb820與Mb2974卻能很好地定殖于玉米根部，推測即使在同一種屬內(nèi)的菌株也可能具有不同的植物宿主偏好性。除個別菌株外，大部分供試菌株定殖植物根部能力與其促宿主植株生長呈正相關(guān)。與之前的研究報道[10]相一致，說明根部是昆蟲病原真菌與宿主植物發(fā)生互作非常重要的一個界面。對于具有促進宿主植物生長能力的菌株而言，在根部定殖的菌群數(shù)量可能決定了該共生真菌對宿主的作用效果。

玉米的營養(yǎng)生長主要集中在苗期階段，視品種不同該階段生長周期為20～35 d。該階段是決定玉米能否高產(chǎn)的關(guān)鍵時期，苗壯、苗齊是大田豐收的基礎(chǔ)。玉米幼苗在3片葉以前所需養(yǎng)分由種子自身供給，從第4片葉開始，植株利用的養(yǎng)分才從土壤中吸收[14]。在同一生境中，無外源肥料供給情況下，幼苗生長差異與釋放在根部的真菌密切相關(guān)。因此，研究重點監(jiān)測了幼苗階段的主要生長指標葉領(lǐng)數(shù)形成與莖稈生長，以比較不同菌株處理后的玉米營養(yǎng)生長情況。菌株Mr1046對玉米幼苗生長后期莖稈生長的增效不顯著，但其根部定殖能力在此時期仍然顯著高于同樣對玉米莖稈生長無促進作用的菌株Mac324，原因可能與該菌株在玉米幼苗生長后期定殖根部的減少有一定關(guān)聯(lián)，但此關(guān)聯(lián)仍需進一步研究證實。

4 結(jié) 論

研究選用綠僵菌菌株主要來源于國外不同國家與地域，均收集于美國農(nóng)業(yè)部昆蟲病原真菌菌種保存中心(USDA-ARSEF Collection，Ithaca，USA)。各菌株來源、宿主昆蟲及遺傳背景較清晰，對綠僵菌營腐生生活階段的種間特異性具有一定的參考價值。研究結(jié)果表明，菌株Mr23、Ma939和Mb820定殖玉米根部與促進玉米植株生長的能力較優(yōu)，可作為候選菌株進一步進行毒力測試從而篩選出具有良好殺蟲與植物生長增效于一體的綠僵菌生防菌株。