龔 娜，陳 珣，劉國麗，肖 軍

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧 沈陽 110161）

食用菌產(chǎn)業(yè)是我國的朝陽產(chǎn)業(yè)，在農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)中的地位日趨重要[1]。食用菌栽培的主要原料有棉籽殼、木屑，隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的不斷擴大，傳統(tǒng)原料供應(yīng)緊張，價格持續(xù)上漲，不僅增加了生產(chǎn)成本，還造成了“菌林矛盾”。因此，亟需尋找新型替代基質(zhì)，以降低闊葉木屑的大量消耗，有效地保護森林資源，緩解食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展與林業(yè)資源的矛盾[1]。中國是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，農(nóng)作物秸稈資源儲量巨大，秸稈中含有食用菌栽培原料最主要的碳源。在物質(zhì)循環(huán)過程中，食用菌通過菌絲體分泌的水解酶及氧化酶降解和利用秸稈中的大分子物質(zhì)，如木質(zhì)素、纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)、多糖等，通過食用菌菌絲的生長的利用子實體形成將其轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)、味美的蛋白質(zhì)[2-4]。

糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus） 分類上屬于擔(dān)子菌門 （Basidiomycota） 層菌綱 （Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 側(cè)耳科 （Pleurotaceae） 側(cè)耳屬（Pleurotus），是現(xiàn)在全球栽培面積和消費量最大的食用菌之一[5]，其適應(yīng)性廣，多種農(nóng)作物秸稈均可作為栽培基質(zhì)[6]。玉米秸稈資源豐富，可替代木屑、棉籽殼，且價格便宜，可作為栽培糙皮側(cè)耳的主要原料[7-8]，既能減少對林業(yè)資源的破壞，又能為實現(xiàn)農(nóng)作物秸稈的就地轉(zhuǎn)化和綜合利用提供有效途徑。

為了更好地了解各糙皮側(cè)耳菌株對玉米秸稈的利用能力，篩選獲得高效利用纖維素、半纖維和木質(zhì)素的菌株是解決玉米秸稈降解利用問題的關(guān)鍵。對不同糙皮側(cè)耳菌株降解利用纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的能力進行初步探究，快速篩選適合秸稈栽培的優(yōu)勢糙皮側(cè)耳菌株。為推廣玉米秸稈應(yīng)用于食用菌栽培提供一定的研究依據(jù)，這對未來食用菌生物轉(zhuǎn)化農(nóng)業(yè)廢棄物的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

18個糙皮側(cè)耳菌株由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所試驗室引種并保存，菌種信息見表1。

表1 糙皮側(cè)耳供試菌株Tab.1 Tested strains of the Pleurotus ostreatus

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、馬鈴薯200 g·L-1、瓊脂粉 15 g·L-1，去離子水 1 000 mL。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、馬鈴薯200 g·L-1，去離子水 1 000 mL。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（CMC-Na培養(yǎng)基）[9]：羧甲基纖維素鈉 2.0 g·L-1、蛋白胨 2.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.88 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、瓊脂粉15 g·L-1，去離子水 1 000 mL，pH 7.0。

木聚糖培養(yǎng)基：木聚糖 10.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、蛋白胨 1.0 g·L-1、硫酸銨 4.0 g·L-1、瓊脂粉 15 g·L-1，去離子水 1 000 mL。

PDA-Bavendamm顯色反應(yīng)培養(yǎng)基[10]：在1 000 mL PDA培養(yǎng)基中加入0.14 mmol·L-1鞣酸。

木質(zhì)素降解培養(yǎng)基[11]：木質(zhì)磺酸鈉20.0 g·L-1、葡萄糖 0.5 g·L-1、豆粕 2.0 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1、CuSO40.375 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 菌種制備

將供試的糙皮側(cè)耳菌株接入PDA培養(yǎng)基及液體種子培養(yǎng)基中進行菌株活化，每個菌種接種3支，待菌絲活性恢復(fù)后備用。

1.2.2 降解利用纖維素菌株的篩選

采用直徑0.5 cm×0.5 cm的打孔器對已經(jīng)活化好的菌種平板進行打孔后，用無菌鑷子將菌餅接入直徑為9 cm的羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板中央，置于25℃條件的生化培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。當(dāng)菌落直徑長到培養(yǎng)皿直徑的2/3時，采用剛果紅溶液進行染色，30 min后清除染液，然后采用NaCl溶液進行脫色，再用清水沖洗培養(yǎng)基。采用游標(biāo)卡尺以“十字劃線法”量取菌落直徑以及水解圈直徑大小，通過比較水解圈直徑與菌落直徑大小的比值及水解圈大小、清晰程度，確定初篩菌株[12]，每組設(shè)置 3個重復(fù)。酶指數(shù)（EI）的計算公式為：

式中：D為水解圈直徑（mm）；d為菌落直徑（mm）。

1.2.3 降解利用半纖維素菌株的篩選

半纖維素主要成分為五碳和六碳的單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，其中木聚糖是最主要的成分[12]。故主要通過比較各菌株菌絲在木聚糖上生長情況來評價各糙皮側(cè)耳菌株對木聚糖的利用能力。采用直徑為0.5 cm的打孔器對已經(jīng)活化好的菌種平板進行打孔，然后將菌餅接入到木聚糖培養(yǎng)基平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。每日觀察菌絲生長情況，培養(yǎng)8 d后以“十字劃線法”量取菌落直徑，比較各菌株菌絲的生長情況。每組設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.4 降解利用木質(zhì)素菌株的篩選

1）木質(zhì)素利用測定

采用直徑為0.5 cm的打孔器對已經(jīng)活化好的各菌種平板進行打孔，接種于PDA-Bavendamm培養(yǎng)基的平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。觀察并記錄菌落周圍是否有棕褐色變色圈產(chǎn)生，有棕褐色變色圈者記為“+”，記錄顯色的時間以及變色的程度，“+”“++”“+++”“++++”表示顯色反應(yīng)逐漸加強。

2） 木質(zhì)素降解率的測定

首先配制濃度為 0、0.025 g·L-1、0.050 g·L-1、0.075 g·L-1、0.100 g·L-1、0.150 g·L-1、0.200 g·L-1的木質(zhì)素磺酸鈉溶液，并測定各濃度溶液在280 nm波長下吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

將活化好的不同菌株種子液按2%接種量接種至木質(zhì)素降解培養(yǎng)基中，置于25℃下恒溫搖床中避光培養(yǎng)9 d，設(shè)置轉(zhuǎn)速為120 r·min-1。待培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液10 000 r·min-1離心10 min后取上清液，經(jīng)稀釋后測定OD280值，根據(jù)線性回歸方程計算上清液中木質(zhì)素磺酸鈉含量[14]。木質(zhì)素降解率（P1，%）計算公式為：

式中：C為發(fā)酵后木質(zhì)素磺酸鈉的含量（g·L-1）。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件檢驗差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同糙皮側(cè)耳對纖維素利用潛力的定性分析

不同糙皮側(cè)耳菌株在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中的生長情況見表2。

由表2可知，通過比較不同糙皮側(cè)耳菌株在羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基上的生長情況，評價不同菌株對纖維素利用能力。試驗表明，不同菌株菌絲生長及產(chǎn)生透明圈的情況存在明顯的差異，說明不同糙皮側(cè)耳菌株均具有一定的纖維素酶活性。在菌絲平均生長速率方面，菌株P(guān)8、P4、P5、P6具有較好的表現(xiàn)且其水解圈直徑也較大。酶指數(shù)方面，菌株P(guān)10和P8表現(xiàn)最好。菌株P(guān)10雖然平均生長速率和透明圈生成情況并不最突出，但酶指數(shù)最高，說明菌株P(guān)10纖維素利用能力高于其他菌株，降解纖維素的能力最強。

表2 不同糙皮側(cè)耳菌株在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)Tab.2 The growth of different Pleurotus ostreatus strains of CMC-Na media

2.2 不同糙皮側(cè)耳對半纖維素利用潛力的定性分析

不同糙皮側(cè)耳菌株在木聚糖中的生長情況見表3。

由表3可知，各菌株在木聚糖培養(yǎng)基上的菌絲直徑存在明顯的差異，菌絲生長速率差異顯著。其中，菌株P(guān)16、菌株P(guān)3、菌株P(guān)14和菌株P(guān)4菌絲生長速度相對較慢。菌株P(guān)10、菌株P(guān)8的生長速度最快，分別為0.99 cm·d-1和0.97 cm·d-1。說明在半纖維素利用方面，菌株P(guān)10和菌株P(guān)8的利用能力較強。

2.3 不同糙皮側(cè)耳菌株對木質(zhì)素降解的能力

2.3.1 不同糙皮側(cè)耳對木質(zhì)素利用潛力的定性分析

利用PDA-Bavendamm培養(yǎng)基對不同糙皮側(cè)耳菌株降解木質(zhì)素能力進行初步篩選，供試不同糙皮側(cè)耳菌株在PDA-Bavendamm培養(yǎng)基中顯色反應(yīng)的試驗結(jié)果見表4。

表4 不同糙皮側(cè)耳菌株在PDA-Bavendamm中的生長情況Tab.4 Growth condition of different Pleurotus ostreatus strains in the PDA-Bavendamm

由表4可知，供試菌株在PDA-Bavendamm培養(yǎng)基中的顯色反應(yīng)均呈陽性，表示各菌株具有降解木質(zhì)素的能力，不同菌株在PDA-Bavendamm平板上顯色反應(yīng)不同。根據(jù)變色圈產(chǎn)生的顏色深淺判斷，所有供試菌株均能降解木質(zhì)素，菌株P(guān)10、P4降解木質(zhì)素能力最強，菌株P(guān)15降解能力較強，菌株P(guān)3、P11降解木質(zhì)素能力最弱。菌株P(guān)10菌落直徑和變色圈直徑均大于其他菌株，說明菌株P(guān)10更能快速降解并利用木質(zhì)素。通過木質(zhì)素降解能力的比較，從中篩選出降解能力最強的菌株為P10。

2.3.2 不同糙皮側(cè)耳菌株的木質(zhì)素降解率

經(jīng)過計算，得到木質(zhì)素磺酸鈉濃度與OD280間的線性回歸方程為：

此線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.998。18種不同糙皮側(cè)耳菌株木質(zhì)素降解率統(tǒng)計見圖1。

圖1 不同糙皮側(cè)耳菌株木質(zhì)素降解率Fig.1 Lignin degradation rates of different Pleurotus ostreatus strains

由圖1可知，各菌株對木質(zhì)素磺酸鈉降解程度存在顯著差異，其中P10菌株木質(zhì)素降解率最高，達到47.13%，降解效果最好。

3 結(jié)論與討論

秸稈主要組分包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。降解木質(zhì)纖維素能有效提高農(nóng)業(yè)廢棄物的利用，篩選纖維素和木質(zhì)素降解能力強的菌株是解決秸稈生物降解問題的關(guān)鍵[15]。自然界中，許多微生物能產(chǎn)生相應(yīng)的酶類降解木質(zhì)素纖維素，食用菌生長發(fā)育過程中碳源的主要來源就是木質(zhì)纖維素，具有極強木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)降解能力和特殊代謝類型的白腐真菌，被認為是主要的木質(zhì)素降解微生物[16-17]。白腐菌在碳循環(huán)中處于核心地位，是目前為止已知的唯一一類可以將木質(zhì)素徹底降解成H2O和CO2的真菌。依據(jù)此降解方式，糙皮側(cè)耳被劃分到白腐菌中[18]。篩選獲得具有高效纖維素降解能力的菌株是高效利用纖維素類物質(zhì)的關(guān)鍵，而評價菌株降解纖維素能力的重要指標(biāo)主要依據(jù)纖維素酶活力[19]。優(yōu)勢糙皮側(cè)耳菌株是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，能極大的提升栽培效益。

多年的食用菌生物降解秸稈的研究表明，不同菌株的降解能力相差較大，側(cè)耳類降解木質(zhì)素纖維素功能較強，在食用菌生物降解秸稈體系中，糙皮側(cè)耳可以說是該體系研究中的模式菌種。試驗初步研究了糙皮側(cè)耳菌株對玉米秸稈利用能力，對各菌株對纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的利用能力進行初步的篩選，明晰不同糙皮側(cè)耳對纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的利用能力，供試菌株通過木質(zhì)素降解率試驗，確定了降解秸稈能力最強的菌株。試驗研究結(jié)果表明，綜合各菌株對纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的利用情況研究，P10菌株的能力最強，降解纖維素的能力中酶指數(shù)最高，為0.97，說明P10菌株纖維素利用能力高于其他菌株，木聚糖培養(yǎng)基上的菌絲直徑菌株P(guān)10的生長速度最快，為0.99 cm·d-1，說明P10菌株半纖維素利用能力高于其他菌株，在木質(zhì)素的實驗中降解率達到47.13%，降解效果最好。