游 萍， 薛曉輝， 肖群英， 李春梅， 劉 唱

(1.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院， 貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州省普通高等學(xué)校生物資源開(kāi)發(fā)與生態(tài)修復(fù)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 畢節(jié) 551700)

土壤微生物是土壤中一切看不見(jiàn)或看不清的微小生物的總稱，嚴(yán)格意義上包括細(xì)菌、古菌、真菌、病毒、原生動(dòng)物和顯微藻類(lèi)。土壤營(yíng)養(yǎng)狀況、pH、質(zhì)地、溫度、水分、通氣性、環(huán)境變更或管理異常等，均會(huì)影響土壤微生物多樣性[1]。土壤微生物可以改變土壤的理化性質(zhì)，進(jìn)行物質(zhì)轉(zhuǎn)化，可以改變土壤的肥力，同時(shí)生活在根際附近的土壤微生物還能改善植物的營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，抑制土著性病原菌的侵染[2]。土壤富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為微生物的生長(zhǎng)提供必要的條件，同時(shí)植物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的分泌物也會(huì)釋放一部分到環(huán)境中去，從而對(duì)微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響[3]。武曉生等[4]研究發(fā)現(xiàn)，不同施肥處理土壤微生物種類(lèi)及數(shù)量存在差異，說(shuō)明不同施肥處理對(duì)土壤微生物組成有一定影響。因此，比較分析不同生育期不同施肥處理對(duì)土壤中主要微生物的影響，在作物栽培、提高肥料利用效率以及土壤資源可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用方面具有一定的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

作為土壤微生物的重要組成部分，細(xì)菌數(shù)量是最多的，占土壤微生物的70%～90%，其次是放線菌，再次是真菌[3]。土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)主要是指土壤中主要微生物類(lèi)群(包括細(xì)菌、真菌、放線菌等)在土壤中的數(shù)量以及各類(lèi)群所占的比率，其結(jié)構(gòu)和功能的變化與土壤的理化性質(zhì)變化有關(guān)[5]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)因人類(lèi)對(duì)土壤的管理而發(fā)生變化，肥料種類(lèi)、施用方式、土壤類(lèi)型及利用方式等復(fù)雜因素的干擾而不同[1,6]。魏蘭芳等[7]在研究小麥蠶豆間作條件下不同施氮量對(duì)作物根際微生物數(shù)量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，施用氮肥時(shí)，間作蠶豆根際細(xì)菌低于單作的。李桂花[8]在研究不同施肥對(duì)土壤微生物活性、群落結(jié)構(gòu)和生物量的影響中提到，單施氮肥降低了土壤中細(xì)菌的數(shù)量。李曉慧等[9]研究發(fā)現(xiàn)，肥料的施用均促進(jìn)了大豆、小麥和玉米根際細(xì)菌數(shù)量的增加，且在玉米和小麥種細(xì)菌數(shù)量的增加與ck相比，其差異均達(dá)到了極顯著水平。苗果園等[10]研究表明，不同作物施肥較不施肥一般明顯有助于微生物的繁衍。陶夢(mèng)慧等[11]研究表明，與ck相比，無(wú)論單施化肥、生物有機(jī)肥 (或有機(jī)肥)還是生物有機(jī)肥(或有機(jī)肥)與化肥混合施用，均不同幅度增加了土壤中細(xì)菌的數(shù)量，但施用生物有機(jī)肥土壤中細(xì)菌數(shù)量比施用化肥和有機(jī)肥處理均高。

貴州喀斯特地貌面積占本地區(qū)土地面積的一半以上[12]，因此土壤薄弱，肥力相對(duì)較差。玉米是禾本科玉蜀黍?qū)僖荒晟荼局参?，是重要的糧食作物和飼料作物，是貴州省的主要農(nóng)產(chǎn)品之一。為改善玉米的品質(zhì)和提高產(chǎn)量，都會(huì)在不同時(shí)期施用一定的化學(xué)肥料?；瘜W(xué)肥料的施用改變了土壤的理化性質(zhì)，影響土壤中微生物的生長(zhǎng)和發(fā)育。不同植物或同一植物不同生育期，其根系分泌物、外滲物和脫落細(xì)胞會(huì)發(fā)生一定的變化，從而影響生活在其附近土壤中的微生物，而不同的微生物由于其生理和代謝的不同，對(duì)土壤肥力和植物的營(yíng)養(yǎng)也會(huì)產(chǎn)生一定的影響。本研究通過(guò)監(jiān)測(cè)不同施肥處理對(duì)玉米生育期土壤微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的影響，為合理施肥提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地點(diǎn)為貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院東區(qū)(105.31637°E,27.293525°N，海拔2 380 m)，位于貴州省畢節(jié)市七星關(guān)區(qū)，地處貴州省西北部，川滇黔三省交匯處，為滇東高原向黔中山原丘陵過(guò)渡的斜坡地帶，屬于亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，年平均氣溫12.8 ℃，多年平均降雨量為812～1 440 mm，多集中在4—6月，占年降雨量的71%，形成了季節(jié)性干旱。主要農(nóng)作物有玉米、小麥、水稻、馬鈴薯、烤煙、油菜等。土壤類(lèi)型為黃壤。

1.2 供試材料

畢節(jié)地區(qū)是貴州省的玉米主產(chǎn)區(qū)，其播種面積占全省的三分之一左右[13]，供試品種選用“畢單15號(hào)”，是畢節(jié)地區(qū)農(nóng)科所2000年用自選玉米自交系雜交組配而成的雜交玉米品種。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)開(kāi)始于2018年4月，播種日期是4月4日，采收日期為9月24日，試驗(yàn)田進(jìn)行統(tǒng)一管理。該基地共有24塊，每塊的面積為6 m×3 m。

試驗(yàn)設(shè)置了對(duì)照(ck)、氮肥(N)、磷肥(P)、鉀肥(K)、氮肥+磷肥(NP)、氮肥+鉀肥(NK)、磷肥+鉀肥(PK)和氮肥+磷肥+鉀肥(NPK)一共8種施肥處理，其中ck為空白對(duì)照，不施肥。每個(gè)處理3次重復(fù)，共24個(gè)小區(qū)，試驗(yàn)田采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，用于長(zhǎng)期定位試驗(yàn)；N肥選用尿素(CO(NH2)2)(含N 46%，300 kg·hm-2)、P肥選用過(guò)磷酸鈣(含P2O512%,60 kg·hm-2)、K肥選用氯化鉀(含K2O 60%，90 kg·hm-2)，其中氯化鉀和過(guò)磷酸鈣全部用作底肥，尿素分2次施用，分別在出苗期、大喇叭口期。播種密度60 000株·hm-2。

1.4 土壤樣品采集與處理

于2018年4月—2018年9月，分別在玉米的播種期、出苗期、拔節(jié)期、大喇叭口期、抽雄期和成熟期這6個(gè)時(shí)期在玉米根系附近進(jìn)行土壤樣品采集(見(jiàn)表2)。播種期采樣點(diǎn)的采土深度和玉米種植深度相同，后期則按照玉米不同生育期的主要根系分布情況決定，一般在1～30 cm。每個(gè)種植區(qū)域按照梅花布點(diǎn)法土轉(zhuǎn)采集5個(gè)點(diǎn)土樣混合，剔除石礫或植物植被殘根等雜物，混勻后置4 ℃冰箱備用。

表1 田間試驗(yàn)肥料用量

表2 土樣采集時(shí)間及溫濕度

1.5 指標(biāo)的檢測(cè)

樣品采集后立即進(jìn)行細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量的測(cè)定。微生物數(shù)量的測(cè)定采用梯度稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件和 IBM SPSS Statistics 21軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理玉米生育期微生物總數(shù)的變化

由圖1可知，不同施肥處理下拔節(jié)期微生物總數(shù)整體較高，其次為抽雄期；出苗期PK和NPK處理微生物總數(shù)為ck的1.83倍和2.09倍，N、P、NP、NK處理低于ck；拔節(jié)期N、NP、NK處理總數(shù)為ck的3.31、2.65、2.11倍，P和PK處理低于ck；大喇叭口期各處理差異不明顯；抽雄期N處理微生物為ck的1.98倍，P、NK、K處理低于ck；NPK處理微生物最大值在出苗期，ck、N、P、NP、NK、PK、PK處理微生物總數(shù)最大值在拔節(jié)期，K處理微生物總數(shù)最大值在抽雄期(圖1)。除P外，其他處理微生物總數(shù)的變化幅度都大于ck，其中N變化幅度最大，其最高值是最低值的6.57倍，其次為NP(圖1)。

圖1 不同施肥處理各生育期微生物總數(shù)

2.2 不同施肥對(duì)玉米生育期土壤細(xì)菌的影響

由表3可知，所有處理播種期和成熟期土壤中的細(xì)菌數(shù)量無(wú)顯著差異，出苗期PK和NPK處理細(xì)菌數(shù)量均極顯著地高于ck，分別為ck的2.24倍和2.63倍；拔節(jié)期N、NP和NK處理細(xì)菌的數(shù)量極顯著地高于ck，分別為ck的3.62、3.00倍和2.31倍；大喇叭口期NK處理細(xì)菌數(shù)極顯著低于ck，ck與N、P、K、NP、PK、NPK間無(wú)顯著差異；抽雄期N處理下的細(xì)菌數(shù)量極顯著地高于ck，為ck的2.41倍，ck與K、P、NP、NK、PK、NPK極顯著差異。K處理細(xì)菌最大值在抽雄期，NPK處理細(xì)菌數(shù)量最大值在出苗期，其他處理細(xì)菌數(shù)量最大值在拔節(jié)期；NPK處理各生育期細(xì)菌數(shù)量均大于ck(表3)。

表3 不同施肥對(duì)玉米生育期土壤細(xì)菌數(shù)量的影響 單位：×104cfu·g-1

2.3 不同施肥對(duì)玉米生育期土壤放線菌的影響

由表4可知，所有處理播種期放線菌數(shù)量無(wú)顯著差異，出苗期和成熟期的放線菌數(shù)量都高于播種期；出苗期K、NK處理放線菌數(shù)量顯著高于ck，為ck的1.58倍和1.63倍，ck與P、NP、PK和NPK，NK無(wú)顯著差異；拔節(jié)期N處理放線菌數(shù)量極顯著高于ck，為ck的1.92倍，ck與P、K、PK、NP、NPK無(wú)顯著差異；大喇叭口期K、NP、NK處理放線菌數(shù)量及顯著高于ck，為ck的1.62、1.64倍和2.09倍，ck與N、P、PK和NPK無(wú)顯著差異；抽雄期ck處理放線菌數(shù)量極顯著的高于P、K、NP、NK、NPK，與N無(wú)顯著差異；成熟期NP處理放線菌的數(shù)量極顯著地高于ck，為ck的1.34倍，ck與NK、PK和NPK無(wú)顯著差異，而極顯著高于N、P、K的處理。

表4 不同施肥對(duì)玉米生育期土壤放線菌數(shù)量的影響 單位：×104cfu·g-1

2.4 不同施肥對(duì)玉米生育期土壤真菌的影響

由表5可知，所有處理播種期和出苗期真菌數(shù)量無(wú)顯著差異；拔節(jié)期PK處理真菌數(shù)量極顯著地高于ck，為ck的1.51倍，ck處理極顯著高于P、NK，分別為P和NK的2.34倍和1.88倍；大喇叭口期NK處理真菌數(shù)量顯著高于ck，為ck的1.53倍，ck處理極顯著高于P、K、PK，為P、K和PK的2.84、3.16倍和2.45倍，ck與N、NP和NPK無(wú)顯著差異；抽雄期ck與N和P無(wú)顯著差異，ck極顯著高于K、NP、NK、PK和NPK，為它們的4.39、2.14、1.55、3.80、2.25倍；成熟期NP處理真菌數(shù)量極顯著地高于ck，為ck的1.56倍，ck顯著高于NPK處理，為NPK的1.85倍，ck與N、P、K、NK、PK、NPK無(wú)顯著差異。不同處理(除P和K)玉米生育期前期的真菌數(shù)量小于后期，且玉米成熟期的真菌數(shù)量均高于播種期；K處理出苗期之后各生育期真菌數(shù)量均小于對(duì)照(表5)。

表5 不同施肥對(duì)玉米生育期土壤真菌數(shù)量的影響 單位：×104cfu·g-1

2.5 不同施肥處理玉米生育期主要微生物的組成

由表6可知，NP處理細(xì)菌的百分組成最高值(拔節(jié)期93.38%)是最低值(成熟期31.29%)的2.98倍，高于ck處理(成熟期60.7%，16.83)的2.18倍，其余處理方式均低于ck處理；P處理放線菌的百分組成最高值(成熟期43.21%)是最低值(拔節(jié)期24.29%)的1.89倍，低于ck處理(成熟期60.7%，拔節(jié)期16.83%)的3.61倍，其余均高于ck處理，最高為NP處理(成熟期66.75%，拔節(jié)期6.44%)的10.36倍；真菌的所有處理方式，百分組成的最高值與最低值的倍數(shù)均高于ck處理(成熟期1.37，拔節(jié)期0.61%)的2.25倍，其中最大的是NK處理(大喇叭口期2.57，拔節(jié)期0.15%)的17.13倍。

表6 不同處理下玉米生育期主要微生物的組成 單位：%

3 結(jié)論和討論

本研究通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析不同施肥處理玉米生育期土壤中主要微生物的數(shù)量變化，表明不同施肥處理對(duì)三大微生物群落結(jié)構(gòu)的影響存在差異，與不施肥相比，N的施用在拔節(jié)期和抽雄期極顯著地提高了細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，而對(duì)真菌沒(méi)有影響，PK的混合施用也在出苗期極顯著提高了微生物總數(shù)、細(xì)菌數(shù)量以及拔節(jié)期真菌的數(shù)量，且施肥處理后三大微生物的百分占比與ck相比均存在差異。

土壤微生物數(shù)量與玉米生長(zhǎng)發(fā)育階段、施肥處理以及二者相互作用有關(guān)，這與馬曉霞[14]、胡元森等[15]、張亞平等[16]的研究結(jié)果一致。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，根系附近土壤微生物的數(shù)量變化與玉米生長(zhǎng)發(fā)育呈一定相關(guān)性。在玉米生育期中，拔節(jié)期微生物數(shù)量相對(duì)是最多的，這與植物新陳代謝旺盛有一定的關(guān)系。ck處理隨著玉米的播種期到成熟期，根系不斷生長(zhǎng)，微生物的數(shù)量在前期：播種期-出苗期-拔節(jié)期相應(yīng)增加，而大喇叭口期降低，抽雄期增加，成熟期微生物數(shù)量降至播種期水平。

通過(guò)對(duì)不同施肥處理玉米生育期土壤主要類(lèi)群微生物的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在相應(yīng)生長(zhǎng)時(shí)期，P處理的情況下，并沒(méi)有促進(jìn)細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng)，其生育期的數(shù)量低于對(duì)照，說(shuō)明P可能抑制了細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng)，而對(duì)真菌來(lái)說(shuō)其生育后期(抽雄期和成熟期)數(shù)量反而高于ck，而相應(yīng)施肥后的生長(zhǎng)期數(shù)量沒(méi)有變化。有研究顯示，低P處理，會(huì)促進(jìn)土壤中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量的增加，但隨著P量的增加，細(xì)菌的數(shù)量反而降低[17-18]，唐宏亮等[19]研究認(rèn)為,短期磷添加能夠顯著增加土壤微生物對(duì)碳源的利用，在一定幅度上能夠提高土壤微生物群落功能多樣性，這與本文的研究結(jié)果不完全一致，有待進(jìn)一步的研究。K的處理，在相應(yīng)生長(zhǎng)期促進(jìn)了放線菌的生長(zhǎng)，對(duì)真菌影響不大，而對(duì)細(xì)菌的數(shù)量在生長(zhǎng)的后期(抽雄期和成熟期)高于ck，但也沒(méi)有明顯差異?；旌鲜┯肞K作為底肥后，能夠顯著地提高相應(yīng)生育期土壤中細(xì)菌數(shù)量，但并不能促進(jìn)放線菌和真菌的生長(zhǎng)。

N施用，第一次與同時(shí)期的ck相比極顯著地提高了細(xì)菌(拔節(jié)期N是ck的3.31倍)和放線菌的數(shù)量，但對(duì)真菌沒(méi)有影響，第二次施用時(shí)，與同時(shí)期的ck相比極顯著地提高了細(xì)菌(抽雄期N是ck的1.98倍)的數(shù)量，但其增加的數(shù)量低于第一次N的施用，對(duì)放線菌和真菌都無(wú)促進(jìn)作用。一般細(xì)菌對(duì)C/N的需求比較低，而N肥的施用，進(jìn)一步降低了土壤中的C/N比，從而促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)。Bardgett 等[18]研究認(rèn)為，氮肥的施用可能會(huì)改變土壤養(yǎng)分有效性，從而促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)，而施瑤等[20]也認(rèn)為，N肥的施用有助于提高土壤中細(xì)菌的數(shù)量，這與本文的研究結(jié)果一致。第一次和第二次細(xì)菌數(shù)量的變化差異較大，是否因?yàn)殚g隔期較短，導(dǎo)致土壤中N的含量過(guò)高引起細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制而導(dǎo)致的，有待進(jìn)一步的研究。但是趙超等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期施用氮肥不僅不能提高土壤中細(xì)菌的數(shù)量，反而會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量的降低。因此對(duì)于長(zhǎng)期施用 N 肥對(duì)土壤微生物群落影響并沒(méi)有得到一致的結(jié)果。梁楚濤等[22]認(rèn)為，不同地區(qū)土壤類(lèi)型不同以及施肥種類(lèi)和方式的多樣性也能導(dǎo)致單施氮肥結(jié)果的差異。且NPK處理的情況下，相應(yīng)生長(zhǎng)時(shí)期(拔節(jié)期和抽雄期)的細(xì)菌和放線菌數(shù)量并沒(méi)有顯著高于ck，這可能因?yàn)樯L(zhǎng)期不同，植物分泌物與N、P、K三者間共同作用導(dǎo)致的，其關(guān)系有待進(jìn)一步的探究。

植物不同生育期，會(huì)對(duì)土壤中的主要微生物群落構(gòu)成產(chǎn)生明顯的影響，而化學(xué)肥料的施用在一定幅度上加劇了土壤三大微生物群落結(jié)構(gòu)的變化幅度。玉米生育期土壤微生物群落中細(xì)菌占優(yōu)勢(shì)，其次是放線菌，真菌含量最少，這與單娜娜等[23]、焦曉光等[24]的研究結(jié)果相同。和ck相比，NP處理增加細(xì)菌生育期內(nèi)的百分組成的變化幅度，其余處理方式均降低細(xì)菌的百分組成的變化，除P處理外，其余處理方式均增加生育期內(nèi)放線菌的百分組變化幅度，最高為NP處理(成熟期66.75%，拔節(jié)期6.44%)的10.36倍，所有處理方式都增加了真菌百分組成的變化幅度，其中最大的是NK處理(大喇叭口期2.57，拔節(jié)期0.15%)的17.13倍。徐瑞富等[25]研究發(fā)現(xiàn)，小麥根際微生物細(xì)菌的數(shù)量在拔節(jié)期到灌漿期的過(guò)程中，其數(shù)量逐漸增多，到灌漿期最大；Chiarini L等[26]研究認(rèn)為，玉米根際微生物群落會(huì)隨生育期的不同發(fā)生變化，在苗生長(zhǎng)初期微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，后期相對(duì)穩(wěn)定。所有處理下，玉米成熟期細(xì)菌的含量幾乎都低于播種期的細(xì)菌含量，放線菌和真菌的含量卻都在成熟期有所增加，放線菌增加的幅度較大。

綜上所述，N的施用在拔節(jié)期和抽雄期極顯著地提高了微生物總數(shù)、細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，而對(duì)真菌沒(méi)有影響，但第一次施用的效果明顯高于第二次；P處理可能抑制了相應(yīng)生育期細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng)，而促進(jìn)生育后期真菌的生長(zhǎng)，K施用促進(jìn)相應(yīng)生育期放線菌的生長(zhǎng)，PK共同施用促進(jìn)相應(yīng)生長(zhǎng)期細(xì)菌數(shù)量；與ck相比，NP增加細(xì)菌百分占比的變化幅度，N、K、NP、PK、NK、NPK增加了生育期內(nèi)放線菌百分占比的變化幅度，所有處理均增加了生育期內(nèi)真菌百分占比的變化幅度。但是土壤所處的環(huán)境復(fù)雜，無(wú)機(jī)肥施用并不能完全解釋土壤微生物的群落變化，需要結(jié)合土壤的基本理化性質(zhì)、作物生長(zhǎng)狀況、土壤管理措施等進(jìn)一步分析研究。