劉曉霞， 李 安， 舒健虹， 羅 維， 王小利

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院草業(yè)研究所， 貴陽 550006；2.貴州大學生命科學學院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護與保護種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心， 貴陽 550025；3.貴州大學動物科學學院， 貴陽 550025)

玉米作為世界上主要的糧食和飼料作物之一，近年來在我國的播種面積不斷加大，成為我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)重要組成部分。玉米對水分敏感，水分已成為制約玉米生產(chǎn)的最重要生態(tài)因子之一。玉米種子萌發(fā)和出苗困難是制約其在干旱地區(qū)生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。張飛等[2]研究表明，對于多數(shù)作物而言，芽、苗期都是對干旱脅迫反應敏感的關(guān)鍵時期，干旱會造成作物種子出苗困難、幼苗根系、葉片等形態(tài)學特征發(fā)生變化，出現(xiàn)葉面積下降、株高變矮現(xiàn)象，使玉米的抗旱性能增強，造成玉米產(chǎn)量降低。因此，作物抗旱性研究日趨重要。依靠植物根際促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)提升作物抗旱性的研究已有報道，趙慧云等[3]進行植物根圍促生菌誘導小麥幼苗耐旱性的研究結(jié)果表明，四種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)處理組的抗旱系數(shù)都顯著高于對照，根圍促生菌能誘導小麥苗期的耐旱性。而枯草芽孢桿菌更多的應用于植物生物病害防治，依據(jù)其生理特征豐富多樣，極易分離培養(yǎng),能產(chǎn)生多種抗菌素和酶?？莶菅挎邨U菌應用于植物病害生物防治的研究已經(jīng)有很多年的歷史[4],目前在黃瓜[5-6]、辣椒[7-8]、水稻[9-10]、小麥[11-13]、玉米[14-16]等農(nóng)作物病害上表現(xiàn)出較好的防治效果。玉米與小麥同為禾本科一年生植物，所以枯草芽孢桿菌可提高小麥耐旱性，具有依靠植物根際促生菌提升玉米抗旱性提供可行性方向與研究的意義。

1 實驗材料與方法

供試玉米品種為金玉818，由貴州省農(nóng)業(yè)科學院旱糧所提供。菌種由貴州省野外采集實驗室保存及生物商品菌肥篩選(表1)。

1.1 菌種制備

1.1.1將菌種培養(yǎng)擴試驗方法

將所測菌種(表1)擴增，調(diào)節(jié)OD600值至0.9左右備用。

表1 試驗菌種來源及編號

1.1.2種子預處理

將選取籽粒飽滿、大小均勻的玉米種子于10%次氯酸鈉溶液下消毒20 min，再用無菌水洗滌3～5遍，自然晾干備用。

1.1.3試驗處理

選擇15%濃度過濾除菌的PEG溶液來模擬干旱條件，以準備好的菌種將消毒的玉米種子置于20 mL菌液中浸泡4 h，撈出玉米種子，自然風干后置于裝有兩層濾紙且滅菌后的培養(yǎng)皿中，倒入20 mL 15%濃度過濾除菌的PEG溶液(ck,無菌水)，每個處理3個重復，每個重復45粒種子，于(25±1)℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。記錄種子起始萌發(fā)的時間,每日記錄發(fā)芽情況，直至不再發(fā)芽為止。

測量指標及方法：自播種起每日記錄起發(fā)芽數(shù)以及發(fā)霉數(shù)，待不再發(fā)芽時相互比較芽長及根長，并稱量其鮮重后放置于烘箱105 ℃烘烤1 d，而后稱量干重。計數(shù)發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)。

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，其中：Gt為t天時種子萌

發(fā)的數(shù)量，Dt為播種后天數(shù)；

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×鮮重；

幼苗含水量=[(SL-G)/SL]×100%,其中：SL為幼苗鮮重，G為幼苗干重。

1.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進行統(tǒng)計分析，方差分析采用SPSS軟件分析

利用如下公式分別計算單項指標抗旱系數(shù)、綜合抗旱系數(shù)、抗旱指數(shù)、隸屬函數(shù)值、抗旱性量度值

單項指標耐旱系數(shù)(PI)=不同濃度處理下的平均測定值/對照測定值

(1)

綜合抗旱系數(shù)

(2)

抗旱指數(shù)

(3)

隸屬函數(shù)值

(4)

(5)

標準差系數(shù)

(6)

權(quán)重系數(shù)

(7)

抗旱性量度值

(8)

式中，Xij和Xj分別表示第i處理第j個指標的隸屬值和所有株系第j個指標的平均值;Xmin和Xmax表示第j個指標的最小值和最大值;m與n分別表示指標的個數(shù)和處理數(shù);計算隸屬函數(shù)值時，若指標與耐旱性呈正相關(guān)用公式(4)，若指標與耐旱性呈負相關(guān)用公式(5)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下不同枯草芽孢桿菌對玉米萌發(fā)的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、幼苗含水量的影響

由表2所示，不同菌種對玉米發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、幼苗含水量的影響不同，玉米發(fā)芽指數(shù)在R 60處理顯著(p<0.05)高于ck，而R 286-5處理顯著低于ck(p<0.05)，其余菌種處理均與ck無明顯差異。不同菌種對玉米活力指數(shù)影響中，R 9、R 60處理下玉米的發(fā)芽活力指數(shù)均顯著(p<0.05)高于ck，其余各處理均與ck無明顯差異，且R 9顯著高于其余各處理下玉米發(fā)芽的活力指數(shù)，除R 9外，R 60均顯著高于其他處理下玉米發(fā)芽的活力指數(shù)。在幼苗含水量方面，除R 286-5處理顯著低于ck，其余各處理組與ck無明顯差異。綜上所述，R 60有利于提高玉米發(fā)芽過程的發(fā)芽勢活力指數(shù)的增長，R 9有利于提高玉米發(fā)芽過程的活力指數(shù)的增長，而R 286-5對于玉米發(fā)芽過程的發(fā)芽勢以及幼苗含水量有顯著的抑制作用，其余各處理對于干旱脅迫下對玉米萌發(fā)過程的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、幼苗含水量無顯著影響。

表2 不同菌種處理對玉米發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、幼苗含水量的影響

2.2 不同菌種在干旱脅迫下對玉米萌發(fā)相關(guān)生長指標的影響

如表3所示，發(fā)芽3 d后的發(fā)芽率在R 29-1處理處最高，但是與ck差異不顯著(p>0.05)，R 40-1、CJ-3、R 286-5、R 60處理均顯著低于ck。發(fā)芽6 d后CJ-2、R 286-5、CJ-3、R 10、R 40-2等菌種的發(fā)芽率均顯著(p<0.05)低于R 24-2、R 60、R 40-2、R 29-1、R 59，R 24-2、R 60、R 40-2、R 29-1、R 59，與ck差異不顯著，且R 40-1、R 286-5均顯著低于ck。發(fā)芽9 d后的發(fā)芽率除R 286-5顯著低于R 24-2、R 60、R 29-2、R 40-2、R 29-1、R 19-2、R 9、R 59，其余各個處理間差異不顯著。在芽長方面，R 60、CJ-4、R 59、R 9、CJ-1、CJ-3、R 40-1、R 29-1均顯著(p<0.05)高于ck，此幾組處理間差異不顯著，而其余各組處理與ck間差異均不顯著。在根長上，R 286-5、R10兩種菌種處理下玉米發(fā)芽期的根長顯著(p<0.05)低于R 59、R 40-1、CJ-2處理，但與ck差異不顯著，其余處理間差異不顯著。對于根數(shù)來說，R 24-2、R 60、CJ-1、CJ-2、CJ-3、CJ-4等菌種處理下，玉米發(fā)芽過程中的根數(shù)顯著高于ck，而R 29-2、R 10兩種菌種處理顯著低于ck。不同菌種處理下對玉米發(fā)芽結(jié)束后鮮重的影響不同，表3所示，CJ-1、CJ-3、CJ-4、R 286-5、R 10、R 40-2處理下玉米發(fā)芽結(jié)束后的鮮重顯著低于ck，而R 59、R 9、R 40-1等處理下玉米發(fā)芽結(jié)束后的鮮重顯著高于ck，其余各處理與ck之間差異不顯著。CJ-1、CJ-3、CJ-4處理下玉米發(fā)芽結(jié)束后的干重顯著低于ck，R 9處理下玉米發(fā)芽結(jié)束后的干重顯著高于ck，其余各處理與ck之間差異不顯著。整體來說，不同菌種的處理下對于玉米發(fā)芽過程的生長指標存在不同影響，明確影響關(guān)系，需要進行更加復雜的運算。

表3 不同菌種處理對玉米相關(guān)生長指標的影響

2.3 干旱脅迫下不同菌種處理下的玉米抗旱性

運用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)公式對各指標進行標準化處理，并且利用標準差系數(shù)賦予權(quán)重法對各指標賦予權(quán)重從而定量地比較株系間的抗旱能力。根據(jù)公式(3)～公式(8)計算相應的隸屬函數(shù)值，抗旱性量度值，綜合抗旱指數(shù);根據(jù)抗旱指數(shù)與權(quán)重計算加權(quán)抗旱指數(shù)。如表4、表5所示，干旱脅迫下不同菌種處理的玉米抗旱性影響不同，綜合指標抗旱系數(shù)并不一致，其中以R 60、R 40-2、R 29-1、R 9、R 19-2、R 59等菌種處理下玉米種子都有較高的綜合指標抗旱系數(shù)，其中R 9菌種處理下玉米種子有最高的綜合指標抗旱系數(shù)，R 286-5和R 9菌種處理下玉米種子都有最低的綜合指標抗旱系數(shù)，表明R 9菌種處理下玉米種子有最高抗旱性，而R 286-5和R 9菌種處理下玉米種子不利于種子對抗干旱的環(huán)境?？购敌粤慷戎荡砹瞬煌N處理下植株株系的抗旱性，以其對各株系進行抗旱性排序，結(jié)果可知各不同菌種處理下植株抗旱性為：R 9>R 60>R 29-1>R 59>R 40-2>R 19-2>R 24-2>CJ-2>R 29-2>R 40-1>ck>CJ-1>R 10>CJ-4>CJ-3>R 286-5。就抗旱性量度值是否能夠客觀地表達出不同菌種處理下植株株系的抗旱性需要與其他數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析。如表6所示，除根長、芽長、根數(shù)以外，抗旱性量度值與其他指標的相關(guān)性均達到顯著水平，且呈正相關(guān)?？购敌粤慷戎导纫紤]各指標的重要性，又要考慮各指標間的相互關(guān)系。因此，用抗旱性量度值綜合評價抗旱性是否較為全面和準確反映各株系的抗旱性，需要對各項指標進行主成分分析，篩選出較為合理指標進行分析。

表4 不同菌種對玉米萌發(fā)指標的抗旱系數(shù)

表5 不同菌種對玉米萌發(fā)指標的抗旱性綜合評價

表6 各指標隸屬函數(shù)值相關(guān)性與抗旱性量度值相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

發(fā)芽率、發(fā)芽勢和種子活力指數(shù)反映植物種子發(fā)芽速度、發(fā)芽整齊度和幼苗健壯的趨勢,常作為評價種子發(fā)芽的指標[17]，不同菌種處理下對玉米萌發(fā)的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和種子活力指數(shù)影響程度不一樣，其中R 60有利于提高玉米發(fā)芽過程的發(fā)芽勢活力指數(shù)的增長，R 9有利于提高玉米發(fā)芽過程的活力指數(shù)的增長，而R 286-5對于玉米發(fā)芽過程的發(fā)芽勢以及幼苗含水量有顯著的抑制作用，說明R 60、R 9兩種菌種可以提高玉米種子萌發(fā)過程中的干旱耐受性，R 286-5不利于提高玉米種子萌發(fā)過程中的干旱耐受性。但是單方面的指標評斷結(jié)果不具有說明性，本試驗中不同菌種處理下玉米的芽長、根長、根數(shù)、鮮重、干重影響不同，運用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)公式對各指標進行標準化處理，并且利用標準差系數(shù)賦予權(quán)重法對各指標賦予權(quán)重從而定量地比較株系間的抗旱能力，該種評價方式用于多指標進行的整體評價，消除了單一指標帶來的片面性，同時進行相關(guān)性分析、隸屬函數(shù)和標準差系數(shù)賦予權(quán)重法的方法將所測指標進行分析，結(jié)果可知，不同菌種處理下植株抗旱性為：R 9>R 60>R 29-1>R 59>R 40-2>R 19-2>R 24-2>CJ-2>R 29-2>R 40-1>ck>CJ-1>R 10>CJ-4>CJ-3>R 286-5。李麗霞等[18]在轉(zhuǎn)AtNHX1基因馬鈴薯田間鹽脅迫下的生理反應及耐鹽性的綜合評價采用該種綜合評價方式，最終以耐鹽性量度值D的大小來衡量耐鹽性的高低，本試驗同樣采用該種方式，并進行抗旱性量度值與指標間的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)除根長、芽長、根數(shù)以外，抗旱性量度值與其他指標的相關(guān)性均達到顯著水平，且呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。所以能夠確定抗旱性量度值既要考慮各指標的重要性，又要考慮各指標間的相互關(guān)系。因此，用抗旱性量度值綜合評價抗旱性較為全面和準確。