梁高照，張國(guó)暉，李 春，汪 清（通訊作者）

（1 深圳市寶安人民醫(yī)院<集團(tuán)>泌尿疾病中心 廣東 深圳 518000）

（2 廣東醫(yī)科大學(xué) 廣東 湛江 524000）

弱精子癥（asthenozoospermia, AZS）是指精子前向運(yùn)動(dòng)（a 級(jí)+b 級(jí)）小于32%的病理狀態(tài)，是男性不育的主要原因之一[1]。健康可育男性精子microRNA,（miRNA）是一類小的、單鏈的非編碼RNA 分子，是基因表達(dá)中的一類調(diào)控因子。在精子發(fā)生過程中，miRNA 以細(xì)胞特異性方式表達(dá)，參與男性生殖細(xì)胞分化的每個(gè)步驟[2]。研究表明，miRNA 表達(dá)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致AZS，是AZS形成的重要原因[3-5]。然而，由于實(shí)驗(yàn)對(duì)象、年齡、實(shí)驗(yàn)方法或miRNA 參考范圍存在差異，各個(gè)研究中心之間關(guān)于AZS 的miRNA 的研究數(shù)據(jù)及表達(dá)譜仍然存在很大差異。鑒于miRNA 調(diào)控在AZS 發(fā)生中的重要作用及各研究中心之間關(guān)于miRNA 表達(dá)譜的參差不齊，旨在鑒定和表征AZS 不育男性和健康可育男性精子中的miRNA 表達(dá)譜，并進(jìn)一步探討miRNA 靶基因的功能聚類及控制通路，預(yù)測(cè)miRNA 在AZS 發(fā)生中的分子機(jī)制。

1.資料與方法

1.1 一般資料

于2018 年12 月—2019 年11 月，選取因不孕不育到深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科就診的年輕男性。（1）AZS 不育組納入標(biāo)準(zhǔn)：25 ～40 歲男性；精液實(shí)驗(yàn)室檢查符合AZS 世界衛(wèi)生組織（World Health Organization WHO）診斷標(biāo)準(zhǔn)：活力PR 級(jí)（a+b 級(jí)）＜32%、精子濃度≥15×106/mL、正常精子形態(tài)≥4%；未育；性激素水平正常；生殖系統(tǒng)體格檢查正常。（2）正常對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：25 ～40 歲男性；精液實(shí)驗(yàn)室檢查正常：PR 級(jí)（a+b 級(jí)）≥32%、精子濃度≥15×106/mL、正常精子形態(tài)≥4%；具有健康子代。（3）排除標(biāo)準(zhǔn)：精液異常（顏色、體積、液化異常）、精漿果糖異常、α-葡糖糖苷酶異常、泌尿生殖道感染。納入的所有男性均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本收集 所有男性禁欲5 d 后收集精液，常溫下液化。采用SCA 全自動(dòng)精液質(zhì)量分析儀對(duì)樣本進(jìn)行常規(guī)分析。分析所有精液樣本的參數(shù)，包括體積、液化時(shí)間、pH、精子數(shù)量、精子活力、精子密度和形態(tài)。液化后立即在-80℃冰箱下保存。

1.2.2 樣本總RNA 提取及質(zhì)量檢測(cè) 精液樣品解凍，分離精漿，純化精子?？俁NA 提取方法參照RNA 提取試劑盒（invitrogen，美國(guó)）使用說明。采用Nanodrop 超微量核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定所提取的總RNA 濃度。1%的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA 樣本質(zhì)量。篩選滿足條件的RNA 樣本保存于-80℃冰箱。

1.2.3 MiRNA 文庫(kù)構(gòu)建 按照QIAseqTM miRNA Library Kit 說明書進(jìn)行文庫(kù)制備，文庫(kù)制備完成后，對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，確保文庫(kù)有效濃度＞2 nmol/L。在HiSeq-2000 系統(tǒng)上進(jìn)行測(cè)序。通過HiSeq 控制軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)分析和堿基識(shí)別。

1.2.4 小RNA 序列分析

測(cè)序下機(jī)后，分析原始數(shù)據(jù)，并刪除低質(zhì)量的reads。修剪3'銜接子序列后，使用miRDeep2 以默認(rèn)參數(shù)從所有文庫(kù)中提取長(zhǎng)度大于17 nt 的小RNA 讀數(shù)，以識(shí)別已知的和新穎的miRNA[6]。每個(gè)庫(kù)分別處理。

1.2.5 靶基因預(yù)測(cè)和信息深度分析 通過miRTarBase 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA 的靶基因。為了全面描述基因和基因產(chǎn)物的特性，我們采用topGO（version 2.18.0）從分子功能、生物過程和細(xì)胞組成三個(gè)方面進(jìn)行了基因本體（gene ontology, GO）注釋和富集分析，采用KOBAS（kobas2.0-20150126）[7]對(duì)篩選到的差異基因進(jìn)行KEGG PATHWAY 富集分析，挖掘差異表達(dá)miRNA 靶基因參與的主要功能及生化代謝途徑。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 一般資料

使用SCA 全自動(dòng)精液質(zhì)量分析儀對(duì)不育組35 例AZS不育患者精液樣本和36 例健康對(duì)照組精液樣本進(jìn)行精液常規(guī)分析。收集并分析組間樣本參數(shù)，發(fā)現(xiàn)組間樣本在年齡、精液體積、pH、液化時(shí)間、精子密度、精子畸形率方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。但弱精癥組精子前向運(yùn)動(dòng)率明顯低于正常對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見表1。

表1 兩組精液樣本參數(shù)比較（ ± s）

表1 兩組精液樣本參數(shù)比較（ ± s）

注：aP ＞0.05，bP ＜0.05。

項(xiàng)目 不育組（n=35） 對(duì)照組（n=36）年齡/歲 33.48±1.716a 30.33±1.871體積/mL 4.33±0.943a 4.33±0.471 pH 7.59±0.162a 7.49±0.067液化時(shí)間/min 25.00±2.454a 26.67±2.491密度/（106?mL-1） 87.82±4.451a 86.27±2.658活力/%（a+b） 24.05±1.232b 69.42±5.977畸形率/% 73.90±4.374a 75.63±3.027

2.2 RNA 純度和濃度

使用Nanodrop 超微量核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)RNA 純度和濃度，結(jié)果顯示大部分樣本所提取的RNA 濃度均處于較低水平；瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA 質(zhì)量發(fā)現(xiàn)RNA條帶不清晰。RNA 樣本篩選閾值設(shè)定為：RNA 濃度大于80 ng/μL、1.8 ＜OD260/OD280 ＜2.0 且RNA 電泳圖條帶清晰。僅有7 個(gè)樣本（不育組4 例和對(duì)照組3 例）滿足上述篩選標(biāo)準(zhǔn)，納入測(cè)序?qū)嶒?yàn)，見表2。

表2 兩組樣本RNA 濃度和純度比較

2.3 基因表達(dá)豐度統(tǒng)計(jì)

基因表達(dá)定量用TPM 作為單位，即每百萬reads 中來自某一基因的reads 數(shù)[10]。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后得到如下的TPM 分布箱式圖，見圖1。

圖1 TPM 分布箱式圖

2.4 miRNA 差異表達(dá)譜

采用二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)序，然后采用edgeR分析miRNA 的表達(dá)水平。本次分析中差異基因的篩選主要從差異倍數(shù)和顯著水平兩方面進(jìn)行評(píng)估，篩選閾值設(shè)定為：|log2（FoldChange）|＞1 且FDR ＜0.01。結(jié)果表明，共有16 個(gè)miRNA 的表達(dá)改變具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中10 個(gè)miRNA 表達(dá)下調(diào)，6 個(gè)miRNA 表達(dá)上調(diào)，見表3。MiR-34c 在弱精癥組中表達(dá)水平明顯下調(diào)，具有最顯著的表達(dá)差異（FDR=9.15×10-5）；miR-34b表達(dá)水平同樣下調(diào)，且表現(xiàn)出了最大倍數(shù)變化（|log2（FoldChange）|＞4）。我們對(duì)不育組和對(duì)照組差異表達(dá)的16 個(gè)miRNA 的相互關(guān)系進(jìn)行分層聚類。觀察到2 個(gè)不同的簇團(tuán)，弱精癥組與正常對(duì)照組差異表達(dá)的miRNA 分別聚類。通過對(duì)差異表達(dá)的16 個(gè)miRNA 的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了這些miRNA參與了9 744 個(gè)靶基因的調(diào)節(jié)，見表3。

表3 符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的miRNA

2.5 miRNA 靶基因信息學(xué)分析

為了更好地了解這些miRNA 的潛在含義，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行了GO 富集分析和KEGG Pathway 富集分析，以評(píng)估其潛在功能。GO 分析結(jié)果表明，miRNA 靶基因顯著富集于不同功能組（P＜0.05）。這些差異表達(dá)的miRNA靶基因參與細(xì)胞代謝過程、RNA 生物合成過程的調(diào)控、RNA 代謝過程的調(diào)控、生物合成過程的調(diào)控等生物過程，參與了細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等細(xì)胞成分；參與蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、酶結(jié)合等分子功能調(diào)節(jié)。我們分別對(duì)上調(diào)的6 個(gè)miRNA 的靶基因和下調(diào)的10 個(gè)miRNA 的靶基因進(jìn)行GO 富集分析，也得出和上訴基本一樣的結(jié)論。KEGG Pathway 富集分析結(jié)果表明miRNA 靶基因明顯富集于90 個(gè)KEGG 途徑（P＜0.05）,涉及的代謝通路非常廣泛。MiRNA 調(diào)節(jié)的最活躍的代謝途徑包括癌癥中的microRNA、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、慢性粒細(xì)胞白血病、膠質(zhì)瘤、大腸癌、內(nèi)分泌抵抗、前列腺癌、細(xì)胞衰老、乙型肝炎、癌癥中的蛋白聚糖，見圖2。

圖2 差異表達(dá)基因KEGG 富集散點(diǎn)圖

3.討論

24%的不育男性因各種因素（精索靜脈曲張、感染或遺傳原因）而出現(xiàn)孤立的AZS[11-13]。然而，許多AZS病例在本質(zhì)上是特發(fā)性的，并且不能將具體原因歸因于該病癥[14]。因此，需要進(jìn)一步研究以更好地了解影響精子前向運(yùn)動(dòng)力的因素，以治療/管理此類病例。精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜過程，涉及眾多miRNA 的精細(xì)調(diào)控。既往已經(jīng)有部分文獻(xiàn)表明miRNA 失調(diào)與AZS 相關(guān)[3-5]。

共收集了35 例AZS 不育男性精液樣本和36 例健康可育男性精液樣本。然而，在檢測(cè)RNA 質(zhì)量時(shí)，結(jié)果顯示，絕大部分樣本（64 例）RNA 濃度偏低，無法建庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)過分析，我們認(rèn)為原因可能包括以下幾點(diǎn)：（1）精子細(xì)胞RNA 含量極低，約為體細(xì)胞RNA 的1/100[15]；（2）精子RNA 主要存在于致密的細(xì)胞核及核周圍[16]，大大增加提取難度；（3）RNA 自身結(jié)構(gòu)中尚存在2 個(gè)游離的羥基，容易進(jìn)攻自身的肽鍵；（4）RNA 是單鏈結(jié)構(gòu)，極不穩(wěn)定，在樣本液化、儲(chǔ)存、及實(shí)驗(yàn)過程中非常容易受外界環(huán)境（溫度、RNA 酶、儲(chǔ)存時(shí)間）影響，導(dǎo)致發(fā)生不同程度的降解，降低RNA 含量。由此可見，提取精子RNA 的難度相對(duì)較大，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及環(huán)境要求比較嚴(yán)格。從以上原因，我們認(rèn)識(shí)到在涉及精子RNA 的實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)該優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，改善實(shí)驗(yàn)條件，避免儲(chǔ)存過長(zhǎng)時(shí)間，嚴(yán)格在低溫條件下進(jìn)行操作，盡量減少RNA降解[17]。

通過下一代測(cè)序平臺(tái)評(píng)估了AZS 不育男性和正常可育男性的精子差異表達(dá)的miRNA 譜。我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和Abu-Halima 等[17]以及Salas-Huetos 等[3]的研究結(jié)果吻合，比如miR-34b 和miR-143 在AZS 患者中均存在表達(dá)失調(diào)。更重要的是，我們還發(fā)現(xiàn)了很多之前未曾報(bào)道與AZS 相關(guān)的miRNA，極大地豐富AZS 中的miRNA 差異表達(dá)庫(kù)，為后續(xù)研究miRNA 調(diào)控AZS 發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制提供了新的方向。相較于健康對(duì)照組，AZS 不育患者中miR-34c 表達(dá)明顯下降，表現(xiàn)出較大的表達(dá)倍數(shù)變化，且具有最顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們認(rèn)為miR-34c 在AZS中具有巨大的潛在作用，有希望成為AZS 的診斷性生物標(biāo)志物和治療的生物靶點(diǎn)。

為了進(jìn)一步了解和提供一些分子信息，以了解AZS 涉及這些miRNA 的生理功能和生物學(xué)過程，基于miRNA/mRNA 的相互作用原理預(yù)測(cè)了靶基因。GO 和KEGG功能注釋結(jié)果表明，miRNA 靶基因的代謝途徑涉及范圍十分廣泛。由此可見，在參與AZS 發(fā)生過程中，miRNA的生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制被整合于多個(gè)途徑中，通過多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)。廣泛的靶標(biāo)范圍及作用途徑充分表明這些miRNA 可能在AZS 發(fā)生的生物學(xué)調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。

本文對(duì)象是青壯年不育男性，文中尚未明確不同年齡組的miRNA 表達(dá)譜是否存在差異，有待進(jìn)一步明確。

綜上所述，AZS 不育男性和健康可育男性的精子miRNA 存在著不同的表達(dá)譜，同時(shí)也豐富了AZS 的miRNA表達(dá)譜，miR-34c 有望成為AZS 的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。miRNA 靶基因顯著富集于多個(gè)生物學(xué)通路中，通過多種信號(hào)通路影響精子的發(fā)生，導(dǎo)致AZS。