陶斯湄 黃際薇 李海波 張英才 楊揚

由于移植技術和免疫抑制劑的快速發(fā)展，肝移植術后移植物的5年存活率已達70%以上[1-3]，但是長期應用鈣調磷酸酶抑制劑（calcineurin inhibitor，CNI）常引起腎損傷、糖尿病、高血壓、神經(jīng)毒性損傷等不良反應[4-6]。如何在有效免疫抑制狀態(tài)下，減少CNI類藥物的用量，從而減輕腎損傷等不良反應是移植學界的普遍共識[7]。

依維莫司已分別于2012年和2013年在歐洲和美國上市，是一種哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制劑，是西羅莫司的羥乙基衍生物[8-9]。其藥物作用機制與西羅莫司相似，不僅抑制細胞因子介導的T細胞增殖，還能減少血管生成[10-12]。臨床研究表明，肝移植受者無論是在術后早期應用依維莫司（術后1個月）或是在術后半年由其他CNI切換，均可有效保護腎功能[13-16]。此外，依維莫司還被認為具有抗腫瘤效果，盡管目前的研究結果表明該結論仍存在一定爭議[17-18]。由于依維莫司的臨床安全治療窗較窄（血藥谷濃度3～8 ng/mL）[19-20]，因此肝移植術后應用依維莫司的受者需要常規(guī)監(jiān)測血藥濃度以調整服藥劑量[21-22]。然而，目前國內對肝移植受者術后依維莫司血藥濃度監(jiān)測方法的研究尚屬空白。本研究通過建立一種快速、簡便、穩(wěn)定的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測體系測定人全血中依維莫司濃度，確定其準確度，旨在建立適用于中國肝移植術后受者依維莫司血藥濃度的監(jiān)測方法，為臨床個體化治療提供決策依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集中山大學附屬第三醫(yī)院和外院肝移植術后正在服用依維莫司的5例受者的外周血樣本5份，其中我院1例，外院4例，均為肝移植術后原發(fā)性肝癌（肝癌）復發(fā)受者，受者自行購藥服用并自愿參加我院的免費依維莫司濃度檢測，均已簽署知情同意書。受者男4例，女1例，平均年齡為52歲。其中外院4例受者于中國香港購藥，藥品規(guī)格為每粒1 mg，給藥頻次為每次1 mg，每日2次，開始服藥時間為術后6～14個月；我院的1例受者服用國內已上市藥物，藥品規(guī)格為每粒5 mg，給藥頻次為每次2.5 mg，每日1次，開始服藥時間為術后13個月。

5例受者中，其中我院1例于術后22個月，外院4例于術后8～19個月進行樣本采集，均為服藥前1 h內，于空腹狀態(tài)下采集靜脈血2 mL，加入乙二胺四乙酸抗凝。

1.2 試劑和儀器

無藥物全血（德國Recipe公司）；依維莫司標準品（批號K1802090，北京阿拉丁公司）；內標物為依維莫司-D4標準溶液（批號FN10251906，德國Merck公司）；高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）級甲醇（德國Merck公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏公司）；質譜級甲酸（美國Fisher公司）；HPLC級甲酸銨（美國Sigma公司）。

4500 Qtrap三重四級桿質譜儀（美國AB science公司）；LC-30AD超高壓二元梯度系統(tǒng)（日本Shimadzu公司）；Basic型分析天平（德國Sartorius公司）；3-18KS高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；數(shù)據(jù)分析處理軟件為AnalystV1.5.2工作站（美國AB science公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件 采用Phenomenex Kinetex PFP色譜柱（100 mm×3 mm，2.6 μm）[10]，柱溫：50 ℃；流速：1 mL/min；流動相A：水（含有2 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸）；流動相B：甲醇（含有2 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸）；進樣量：1 μL；洗脫方式：梯度洗脫，其中0～0.5 min，80%A，0.5～1.5 min，80% 到5%A，保持1.5 min，3～3.01 min，5%～80%A，保持1.5 min，停止；自動進樣器溫度設定為10 ℃。該方法的總運行時間為4.5 min。

1.3.2 質譜條件 離子源：電噴霧電離源（ESI源）；離子極性 ：正離子模式；掃描方法：多反應監(jiān)測（MRM）；依維莫司和內標物的檢測離子對分別為核質比（m/z）975.6 → 908.6，m/z 979.6 → 912.6；兩者使用相同的碰撞能量、正離子模式優(yōu)化去簇電壓、碰撞室射出電壓，分別為25、71、20 V。

1.3.3 標準品與內標物的制備 精密稱取標準品依維莫司10 mg，置于小燒杯中，用適量甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得1 mg/mL標準品母液，作為貯備液。依維莫司工作溶液由儲備溶液制得，濃度分別為1、10、100、1 000 μg/mL。內標物依維莫司-D4工作溶液的濃度為15 ng/mL。儲備液和所有工作溶液配置后放置于4℃冰箱中保存，備用。

標準樣本（standard，STD）和質量控制樣本（quality control，QC）是用無藥物全血加入依維莫司的工作溶液中制備得到。STD線性范圍為1～100 ng/mL。QC分為低、中、高3個水平，濃度分別為3.31、13.00、41.50 ng/mL。STD和QC配置后裝入1.5 mL聚丙烯管中，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.4 樣本前處理 在體積為100 μL的乙二胺四乙酸抗凝全血中分別加入10 μL內標工作溶液、20 μL硫酸鋅（0.5 mol/L）和200 μL甲醇后，渦旋混合30 s。然后將樣品放在-20 ℃中保持5 min以完成蛋白質沉淀并于4 ℃下以23 950×g離心7 min。

1.4 標準曲線繪制

采用STD依維莫司峰面積/依維莫司-D4 峰面積（y）和依維莫司濃度/依維莫司-D4濃度（x）進行線性回歸（1/x2）分析，計算校準函數(shù)。5例樣本的依維莫司血藥谷濃度通過測得其峰面積與內標物峰面積、內標物濃度，代入標準曲線函數(shù)計算得出。

2 結 果

2.1 依維莫司標準曲線及QC數(shù)據(jù)

在定量范圍為1～100 ng/mL的情況下，質控準確度都在15%以內，各分析物在標準曲線S1點和實際樣本中均無明顯干擾，峰形良好（表1）。

表1 依維莫司標準曲線質控的準確度結果Table 1 Accuracy results of quality control of everolimus standard curve

2.2 依維莫司標準曲線的線性分析

依維莫司的回歸方程為y=0.0556x-0.00195（R2=0.998），依維莫司標準曲線的決定系數(shù)（R2）＞0.99，表明依維莫司在血藥濃度1～100 ng /mL范圍內線性關系良好，可用于該藥物在全血中的含量測定（圖1）。

圖1 依維莫司的標準曲線Figure 1 Standard curve of everolimus

2.3 依維莫司標準曲線應用

使用依維莫司標準曲線測得5個臨床樣本的依維莫司血藥谷濃度范圍為3.77～9.27 ng/mL，均在標準曲線范圍內。根據(jù)文獻[ 17]，依維莫司的有效血藥谷濃度范圍為3～8 ng/mL。本研究測得的5例受者的依維莫司血藥谷濃度，4例在治療窗內，1例血藥谷濃度＞8 ng/mL（表2）。

表2 5例肝移植受者的依維莫司血藥谷濃度檢測結果Table 2 Test results of everolimus trough blood concentration in 5 liver transplant recipients

3 討 論

既往的藥代動力學數(shù)據(jù)表明，依維莫司血藥谷濃度≥3.0 ng/mL才能夠發(fā)揮免疫抑制作用，減少排斥反應的發(fā)生；而血藥谷濃度＞8 ng/mL可導致藥物相關不良反應增加，包括脂代謝異常、蛋白尿和血細胞三系減少等[23-27]。因此，推薦的依維莫司血藥谷濃度范圍為3～8 ng/mL[28]。與西羅莫司相比，依維莫司的優(yōu)點包括具有更短的半衰期（約60 h 比30 h）和血藥濃度更快到達穩(wěn)態(tài)水平（6 d比4 d）[29]。鑒于這些特點，臨床應用中依維莫司的劑量較容易調整，并且不需要負荷劑量[30-31]。但是，依維莫司有效的血藥谷濃度窗口相對較窄，為3～8 ng/mL。因此，建立準確易用的依維莫司血藥濃度測定方法對肝移植受者術后的藥物劑量調整和個體化醫(yī)療決策選擇具有重要意義[32-35]。

在本研究中，筆者開發(fā)并優(yōu)化了一個簡單的樣品制備方案，與以往報道相比[36-37]，本研究僅用甲醇和硫酸鋅沉淀蛋白質，無需固相萃取或氮氣吹干復溶等樣本前處理方法；只需100 μL全血，無需復雜的樣品制備即可達到足夠的定量下限。在總運行時間4.5 min內獲得了良好的線性關系和較高的準確度。本研究建立的UPLC-MS/MS測定肝移植受者中依維莫司血藥濃度的方法準確度高、樣品處理方法簡便、檢測時間短，適用于依維莫司的治療藥物監(jiān)測。未來還需進一步對該方法的長期穩(wěn)定性、基質效應和遺留效應等進行驗證，為該藥臨床精準應用作鋪墊。