宋克芹 肖琦 肖建生 羅凱鋒

腎移植是終末期腎病病人的首選治療方法[1]，腎移植的成功依賴于高質量的供腎，供腎的缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是不可避免的，有研究表明IRI是急性腎損傷、移植腎功能延遲恢復和急慢性排斥反應的危險因素[2]。

近年來，應用亞低溫（30～34 ℃）來減輕IRI越來越受到關注。過去多數研究認為亞低溫減輕IRI與降低能量代謝有關，近年來的研究發(fā)現，當機體溫度降低時，生物體會產生一組蛋白來適應環(huán)境的變化，通常我們稱此組蛋白為冷休克蛋白。RNA結合基序蛋白 3（RNA-binding motif protein 3，RBM3）是哺乳動物重要的冷休克蛋白，在32～34 ℃條件下RBM3的表達量最高[3]。RBM3屬于應激反應蛋白，在其N段具有RNA結合區(qū)域，擁有一個保守的RNA識別基序，包含兩個核糖核蛋白結構域[4]，在應激反應中，RBM3可以結合并改變信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的翻譯。研究發(fā)現，RBM3可與Yes相關蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）mRNA的3’非翻譯區(qū)結合，改變其穩(wěn)定性及翻譯效率[5]。YAP1是Hippo通路中最重要的效應因子之一，是調節(jié)細胞增殖、凋亡和器官再生的重要蛋白[6]。YAP1亦可上調核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的表達[7-8]，轉錄因子Nrf2是抗氧化和細胞保護系統(tǒng)的主調節(jié)因子。亞低溫減輕腎臟IRI與RBM3及其下游效應分子YAP1的關系尚未見報道，本實驗通過建立大鼠雙側腎臟IRI模型并用亞低溫進行預處理后，探討亞低溫對腎臟IRI的作用和RBM3及其下游效應分子YAP1/Nrf2在這一過程的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

200～250 g的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性SD大鼠18只，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，飼養(yǎng)于武漢大學中南醫(yī)院動物實驗中心，隨機分為正常對照（normal control，NC）組、IRI組和亞低溫預處理（mild hypothermia preconditioning，MHP）組，每組6只。本研究經武漢大學動物實驗倫理委員會審批通過。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液套裝、脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）檢測試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司，β-肌動蛋白（β-actin）、YAP1、B淋巴細胞瘤（B-cell lymphoma，Bcl）-2、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）一抗和相應二抗均購自武漢三鷹生物技術有限公司，RBM3一抗購自英國Abcam公司，Nrf2一抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

主要儀器：智能恒溫控制儀購自天津建科試驗儀器廠，光學顯微鏡（光鏡）及熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，低溫高速離心機購自上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司。

1.3 模型建立和標本獲取

IRI組大鼠用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥于有加熱墊的操作臺上，使體溫維持在（37±0.5）℃，沿腹中線剃毛并消毒，暴露腹腔后游離雙側腎蒂，用2-0縫線結扎阻斷腎動、靜脈血流45 min后打開，關閉腹腔。MHP組大鼠麻醉和消毒同IRI組，用75%乙醇擦拭腹部快速降溫至32℃左右，使其體溫維持在（32±0.5）℃[9]，2 h后緩慢升溫至37℃左右，按前述方法建立腎臟IRI模型。NC組大鼠除了不阻斷腎動、靜脈血流外，其余處理同IRI組。

術后自由進食飲水，24 h后再次麻醉，收集血液標本和腎臟組織，部分組織放液氮中保存、部分組織放4%多聚甲醛中固定后行HE染色。每組分別取6只大鼠的標本用于后續(xù)實驗。

1.4 實驗方法

1.4.1 血清肌酐水平檢測 采用全自動生化儀檢測血清肌酐水平。

1.4.2 腎臟組織HE染色和病理損傷評分 腎臟組織經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。石蠟切片切成5 mm，按標準過程進行HE染色[10]。光鏡下觀察和拍照。由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法對組織損傷程度進行評分。評分標準如下：隨機選取10個無重疊的視野（×200），評分反映小管壞死、刷狀緣脫落、管型形成和小管擴張的分級，分別為0分（無）、1分（≤10%）、2分（11%～25%）、3分（26%～45%）、4分（46%～75%）和5分（≥76%）[11]。

1.4.3 蛋白質印跡法檢測組織蛋白 提取各組大鼠腎臟組織總蛋白后加入10%的分離膠中，電泳、轉膜后封閉，置于1:1 000 的一抗（RBM3、YAP1、Nrf2、Bcl-2、Bax）溶液中4 ℃孵育過夜，洗滌后加入1:5 000的二抗溶液室溫孵育2 h，用超敏化學發(fā)光劑液在暗室中顯影，用β-actin作為內參。采用Image J軟件定量分析各組RBM3、YAP1、Nrf2蛋白相對表達量和Bcl-2/Bax比值。

1.4.4 免疫組織化學法檢測組織蛋白 將石蠟切片進行脫蠟水化和抗原修復，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌，過氧化氫孵育后封閉，滴加一抗RBM3（1:500）、YAP1（1:1 000）溶液4 ℃過夜，PBS洗滌，滴加1:1 000的二抗溶液室溫孵育50 min，PBS洗滌后滴加顯色液，蘇木素復染后封片，光鏡下觀察和拍照，觀察各組RBM3、YAP1陽性細胞分布情況。

1.4.5 TUNEL法檢測細胞凋亡 石蠟切片經脫蠟水化，在切片上滴加TUNEL反應液37℃孵育2 h，PBS洗滌后滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min，PBS洗滌后封片，使用熒光顯微鏡觀察并采集圖像，比較各組腎臟組織細胞凋亡率。

1.4.6 氧化應激相關指標檢測 按照MDA和SOD檢測試劑盒說明書，逐步加入樣本及試劑于96孔板中，用酶標儀測定吸光度值，分別計算各組MDA含量和SOD活性。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠腎功能和腎臟組織病理學表現

NC組、IRI組、MHP組血清肌酐分別為（29.7±2.8）、（407.1±13.5）、（317.3±14.4）μmol/L，IRI組和MHP組血清肌酐水平均高于NC組，而MHP組血清肌酐水平低于IRI組，差異均有統(tǒng)計學意義（均為P＜0.05）。腎臟組織HE染色結果顯示，NC組腎臟結構基本正常，IRI組與MHP組均可見腎小管壞死，胞核固縮深染、碎裂或溶解，胞質嗜酸性增強，皮髓質交界處淤血，髓質集合管擴張，上皮扁平化，可見蛋白管型形成，MHP組腎臟組織小管壞死、淤血面積小于IRI組，且小管擴張程度更輕、蛋白管型形成更少（圖1A）；NC組、IRI組、MHP組腎臟組織病理損傷評分分別為（0.78±0.12）、（4.57±0.29）、（3.03±0.60）分，IRI組和MHP組病理損傷評分均高于NC組，而MHP組評分低于IRI組，差異均有統(tǒng)計學意義（均為P＜0.05，圖1B），提示亞低溫預處理對腎臟IRI具有保護作用。

2.2 各組大鼠腎臟組織蛋白表達水平

蛋白質印跡法檢測結果顯示，與NC組比較，IRI組和MHP組RBM3、YAP1和Nrf2蛋白相對表達量均升高（均為P＜0.05），并且MHP組較IRI組更高（均為P＜0.05）；與NC組比較，IRI組和MHP組Bcl-2/Bax比值均降低（均為P＜0.05），MHP組Bcl-2/Bax比值較IRI組升高（P＜0.05），提示亞低溫預處理可上調RBM3、YAP1、Nrf2蛋白表達和Bcl-2/Bax比值（圖2）。免疫組織化學染色結果顯示，NC組RBM3和YAP1陽性細胞數最少，MHP組陽性細胞數最多，IRI組陽性細胞數量位于二者之間，提示亞低溫預處理可上調RBM3與YAP1蛋白的表達（圖3）。

圖2 各組大鼠腎臟組織蛋白表達水平比較Figure 2 Comparison of protein expression levels in kidney tissues of rats among each group

圖3 各組大鼠腎臟組織RBM3和YAP1陽性細胞分布情況（免疫組織化學，×200）Figure 3 Distribution of RBM3 and YAP1 positive cells in kidney tissues of rats among each group

2.3 各組大鼠腎臟組織細胞凋亡情況

TUNEL染色結果顯示，NC組、IRI組、MHP組腎臟組織細胞凋亡率分別為（0.76±0.15）%、（10.42±0.42）%、（3.79±0.33）%，IRI組和MHP組細胞凋亡率均高于NC組（均為P＜0.05），MHP組細胞凋亡率低于IRI組（P＜0.05），提示亞低溫預處理可減輕腎臟IRI引起的細胞凋亡（圖4）。

圖4 各組大鼠腎臟組織細胞凋亡率比較Figure 4 Comparison of the apoptosis rate in kidney tissues of rats among each group

2.4 各組大鼠腎臟組織氧化應激水平

MDA含量檢測結果顯示，NC組、IRI組、MHP組MDA含量分別為（0.52±0.07）、（1.38±0.03）、（0.80±0.06）nmol/mg，IRI組 和 MHP組 MDA 含量均高于NC組，MHP組MDA含量低于IRI組，差異均有統(tǒng)計學意義（均為P＜0.05）。SOD活性檢測結果顯示，NC組、IRI組、MHP組SOD活性分別為（1 060±63）、（499±28）、（833±54）U/mg，IRI組和MHP組SOD活性均低于NC組，MHP組SOD活性高于IRI組，差異均有統(tǒng)計學意義（均為P＜0.05）。提示亞低溫預處理可減輕腎臟IRI所致氧化應激損傷并增強抗氧化能力（圖5）。

圖5 各組大鼠腎臟組織氧化應激水平比較Figure 5 Comparison of oxidative stress levels in kidney tissues of rats among each group

3 討 論

IRI是腎移植過程不可避免的損傷，這是影響移植物長期存活的重要因素。IRI主要是血流再灌注后組織內黃嘌呤氧化酶生成的氧自由基引起的，另外再灌注時，細胞外Ca2+進入細胞內，進一步加重鈣超載，Ca2+濃度增加還可以使磷脂酶、蛋白酶激活，導致細胞不可逆性損傷[12]。國內外學者一直在尋找能夠減輕IRI的方法，這些措施包括缺血預處理、缺血后處理、藥物處理、基因調控以及機械灌注等[13-18]。

近年來，應用亞低溫來減輕器官組織IRI越來越受到學者們的關注。亞低溫治療是指將病人的體溫降至30～34 ℃而達到預防或治療疾病目的的方法，應用亞低溫預防組織IRI已有很多的研究報道[19]。亞低溫治療在實驗性腦卒中模型和卒中病人中被公認為有效的神經保護方法，并擴展了其他神經保護劑的治療窗口[20]。在肝臟IRI動物模型中，亞低溫預處理可以減輕肝臟IRI所致線粒體損傷和氧化應激損傷[21-22]。在本實驗中，MHP組的血清肌酐水平及腎臟組織病理損傷評分均低于IRI組，證實了亞低溫預處理對腎臟組織IRI具有保護作用。亞低溫對IRI保護作用的機制可能不僅僅與降低能量代謝有關，當生物體溫度下降時會產生RBM3蛋白，當體溫為32℃時可誘導其高表達[3]。RBM3不僅在低溫環(huán)境下表達量上升，在一些癌癥組織以及低氧環(huán)境中表達也會上調[23-24]。在本實驗中，MHP組RBM3蛋白表達量高于IRI組，提示腎臟組織在缺氧和亞低溫環(huán)境的雙重刺激下誘導了RBM3蛋白高表達。

研究發(fā)現RBM3可以與YAP1的mRNA 3’-非翻譯區(qū)相結合，控制其轉錄和翻譯，YAP1是RBM3蛋白的靶蛋白之一[5]。YAP1蛋白是Hippo通路中最重要的效應因子之一，是調節(jié)細胞增殖、凋亡和器官再生的重要蛋白[6]。以往研究顯示，YAP1在前列腺癌、胰腺癌、膽囊癌以及胃癌等多種腫瘤中表達異常升高，具有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的功能[25-28]。在本實驗中，YAP1蛋白的表達趨勢與RBM3一致，二者在MHP組表達量最高；同時，MHP組細胞凋亡率明顯低于IRI組，提示亞低溫預處理可減少細胞凋亡，Bcl-2/Bax比值升高，表明細胞抗凋亡能力增強，其作用機制可能為亞低溫通過上調RBM3和YAP1蛋白抑制細胞凋亡。

氧化應激損傷是IRI的另一重要病理生理過程，氧化應激損傷是由血流再灌注后組織內黃嘌呤氧化酶生成的氧自由基引起的，當體內氧自由基的生成量超過體內抗氧化防御機制則會產生氧化應激損傷。MDA是IRI誘導的線粒體損傷的標志[29]，SOD是抗氧化防御機制的重要組成部分，有利于過氧化物的去除和還原[30]。在本實驗中，通過檢測MDA含量和SOD活性來評估氧化應激損傷，結果顯示MHP組的MDA含量較IRI組明顯下降，SOD活性較IRI組明顯升高，提示亞低溫處理可降低MDA含量和提升SOD活性，表明亞低溫治療可以減輕大鼠腎臟IRI的氧化損傷并改善抗氧化防御系統(tǒng)。但亞低溫減輕氧化應激損傷的作用機制尚不明確，是否與亞低溫誘導的YAP1蛋白相關？在卵巢癌和膀胱癌化學藥物治療耐藥的研究中發(fā)現，YAP1的表達上調伴隨著Nrf2的表達增加，而沉默YAP1的表達伴隨著Nrf2的表達下調，并且YAP1表達下調后細胞的抗氧化活性降低[6-7]。轉錄因子Nrf2是抗氧化和細胞保護系統(tǒng)的主調節(jié)因子。在生理條件下，Nrf2會降解，細胞氧化應激觸發(fā)Keap1 Nrf2復合體的構象變化，從而阻止Nrf2的降解，未降解的Nrf2與小Maf蛋白形成異二聚體，并通過抗氧化反應元件/親電反應元件激活靶基因以保護細胞[31-32]。在本實驗中，Nrf2的表達與YAP1的表達趨勢一致，結合YAP1的表達趨勢又與RBM3相一致，說明亞低溫減輕氧化應激損傷的作用機制可能是通過RBM3/YAP1/Nrf2通路來實現的。

綜上所述，亞低溫預處理對腎臟IRI具有保護作用，可減輕IRI所致細胞凋亡和氧化應激損傷，其機制可能通過誘導RBM3及其下游分子YAP1/Nrf2蛋白表達上調來實現，但具體作用機制還需進一步論證。本研究為亞低溫預處理減輕IRI提供了新的見解，為減輕供腎IRI提供了潛在的新的分子靶點。