王海鳳，胡江波，許夢(mèng)婷，唐賽賽

（山東中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，山東煙臺(tái) 264199）

香菇是起源于我國(guó)的世界第二大食用菌［1］。香菇多糖（Lentinan，LNT）是一種從香菇中提取的活性成分，是純化的β-1,3-葡聚糖［2］。目前，香菇多糖在臨床上被廣泛用于腫瘤的輔助治療。腫瘤耐藥性的產(chǎn)生是導(dǎo)致治療失敗的主要原因，逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性是提高腫瘤治療療效的關(guān)鍵。本研究以胃癌細(xì)胞SGC7901為模型，探討香菇多糖聯(lián)合阿霉素對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡及耐藥基因表達(dá)的影響，為香菇多糖抗腫瘤作用機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞株SGC7901購(gòu)自上海美軒生物科技有限公司。

1.2 試劑

香菇多糖（批號(hào)1902271）、注射用鹽酸阿霉素（ADR）（25 mg，批號(hào)：G1823064）、RPMI-1640完全培養(yǎng)基（KGM31800S-500）、CCK8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（KGA317）、Trizon Reagent（CW0580S）、Ultrapure RNA超 純RNA提 取 試 劑 盒（CW0581M）、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒（CW2569M）、UltraSYBR Mixture（CW0957M），均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Annexin V-APC/7-AAD apoptosis kit（AP105-100kit）購(gòu)自MULTI SCIENCES公司。

1.3 儀器

CO2培養(yǎng)箱（BPN-80CW），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡（MF53），廣州市明美光電有限公司；多功能酶標(biāo)儀（02L3006），TECAN；熒光 PCR儀（CFX Connect?實(shí)時(shí)），伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；低溫高速離心機(jī)（TGL-16D），常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；NovoCyte?流式細(xì)胞儀（NovoCyte 2060R），艾森生物（杭州）有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 CCK8法檢測(cè)香菇多糖對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)7組，分為空白對(duì)照組、6個(gè)不同濃度香菇多糖實(shí)驗(yàn)組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC7901細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板的100 μL培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至貼壁約70%。實(shí)驗(yàn)組向完全培養(yǎng)基中按20%的比例加入用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的香菇多糖，使其終濃度依次為10 μg/mL、30 μg/mL、50 μg/mL、70 μg/mL、100 μg/mL 和 200 μg/mL， 空 白 對(duì) 照組加等體積培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK8檢測(cè)溶液，再置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，振蕩混勻，在酶標(biāo)儀上于波長(zhǎng)450 nm處讀取光密度值（OD值），重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)率，見式（1）。以生長(zhǎng)率大于90%的最高藥物濃度作為非細(xì)胞毒性濃度，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥量。

細(xì)胞生長(zhǎng)率=(實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值 )×100%。

1.4.2 細(xì)胞造模及分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC7901細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，用1×PBS洗兩遍，用0.25%胰酶（含0.02% EDTA）消化，離心、洗滌、重懸，按40%比例將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞完全貼壁后，棄去上清，設(shè)空白對(duì)照組、阿霉素組（ADR組）、阿霉素和香菇多糖聯(lián)合用藥組（ADR+LNT組）。空白對(duì)照組加培養(yǎng)液1 000 μL，ADR組向SGC-7901細(xì)胞中加入含ADR（5.0 μg/mL）的培養(yǎng)液 1 000 μL，ADR+LNT 組向 SGC-7901細(xì)胞中加入含ADR（5.0 μg/mL）與20%香菇多糖（終濃度為上述非細(xì)胞毒性濃度）培養(yǎng)液1 000 μL，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行流式檢測(cè)和PCR檢測(cè)。

1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)阿霉素與香菇多糖聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

收集1×106～3×106個(gè)細(xì)胞，加1 mL PBS，1 500 r/min離心3 min，洗2遍，用雙蒸水將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer，取 300 μL 預(yù)冷的 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。每管各加入3 μL的Annexin V-APC和5 μL的7-AAD，混勻后，室溫避光孵育10 min，再向每管中加入200 μL預(yù)冷的 1×Binding Buffer，上機(jī)檢測(cè)。

1.4.4 qPCR檢測(cè)香菇多糖對(duì)多藥耐藥相關(guān)基因的影響

按試劑盒說明書，抽提各組SGC7901細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算出各組ZNF139、MRP-1、MDR1的相對(duì)表達(dá)量。ZNF139、MRP-1、MDR1引物序列見表1。

表1 ZNF139、MRP-1、MDR1引物序列表

反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，檢測(cè)各組SGC7901細(xì)胞內(nèi)ZNF139、MRP-1、MDR1表達(dá)情況。1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，獨(dú)立樣本之間比較采用方差分析，以P＜0.05作為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度香菇多糖對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖的影響

由表2可知，30 μg/mL香菇多糖（生長(zhǎng)率93.3%）為非細(xì)胞毒性濃度，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥量。

表2 不同濃度香菇多糖對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖影響表（±s ，n=3）

表2 不同濃度香菇多糖對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖影響表（±s ，n=3）

注：與空白對(duì)照組比較，*表示P＜0.05，#表示P＜0.01。

組別OD值生長(zhǎng)率/（%）空白對(duì)照組 1.25±0.11 100 10 μg/mL 香菇多糖組 1.27±0.15 103.9±17.3 30 μg/mL 香菇多糖組 1.15±0.11 93.3±15.5 50 μg/mL 香菇多糖組 1.11±0.09 89.9±13.2 70 μg/mL 香菇多糖組 1.07±0.14* 86.9±17.4 100 μg/mL 香菇多糖組 0.88±0.12# 71.0±10.9*200 μg/mL 香菇多糖組 0.12±0.12# 9.8±1.03#

2.2 香菇多糖對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡率的影響

由表3可知，與空白對(duì)照組比，ADR組和ADR+LNT組SGC7901細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。與ADR組相比，ADR+LNT組SGC7901細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。

表3 香菇多糖對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡率的影響表（±s ，n=3）

表3 香菇多糖對(duì)SGC7901細(xì)胞凋亡率的影響表（±s ，n=3）

注：*表示與空白對(duì)照組比較，P＜0.01；#表示與ADR組比較，P＜0.01。

組別凋亡率/（%）空白對(duì)照組 6.27±0.43 ADR 組 8.44±0.03*ADR+LNT 組 11.73±0.25*#

2.3 香菇多糖對(duì)SGC7901細(xì)胞耐藥基因表達(dá)的影響

由表4可知，與空白對(duì)照組比，ADR組ZNF139、MDR1、MRP-1基 因 的 表 達(dá) 明 顯 升 高（P＜ 0.01），ADR+LNT組MRP-1基因的表達(dá)明顯降低。與ADR組相比，ADR+LNT組ZNF139、MRP-1基因的表達(dá)明顯降低（P＜0.01），MDR1表達(dá)有降低趨勢(shì)但無顯著性差異。

表4 香菇多糖對(duì)SGC7901細(xì)胞ZNF139、MDR1、MRP-1表達(dá)的影響表（±s ，n=3）

表4 香菇多糖對(duì)SGC7901細(xì)胞ZNF139、MDR1、MRP-1表達(dá)的影響表（±s ，n=3）

注：*表示與空白對(duì)照組比較，P＜0.01；#表示與ADR組比較，P＜0.01。

組別 ZNF139 MDR1 MRP-1空白對(duì)照組 1±0 1±0 1±0 ADR 組 1.75±0.10* 1.35±0.15* 1.45±0.14*ADR+LNT 組 1.05±0.09# 1.12±0.13 0.63±0.05*#

3 討論

化療可有效遏制胃癌細(xì)胞的增殖，但在化療中胃癌細(xì)胞多藥耐藥（MDR）的產(chǎn)生常導(dǎo)致化療效果不佳［3］。阿霉素是廣譜抗腫瘤藥物，其本身毒性較大，但治療效果明顯，至今依然沿用。2017年阿霉素被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)在致癌物清單中，所以減少用量以及與其他抗癌藥物聯(lián)用成了新的研究趨勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度香菇多糖對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)（表2），低濃度香菇多糖（10 μg/mL）對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)香菇多糖濃度達(dá)到30 μg/mL時(shí)開始抑制細(xì)胞增殖，當(dāng)香菇多糖濃度達(dá)到100 μg/mL及以上時(shí)可顯著抑制SGC7901細(xì)胞增長(zhǎng)（P＜0.05、（P＜0.01），表明香菇多糖必須達(dá)到一定的藥物濃度方能起到抗腫瘤作用。通過流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（表3），香菇多糖聯(lián)合阿霉素應(yīng)用可明顯誘導(dǎo)胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的發(fā)生，說明香菇多糖與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，為阿霉素聯(lián)合用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

介導(dǎo)腫瘤耐藥的蛋白包括P-糖蛋白（P-Glycoprotein，P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（Multidrug Resistance-Associated Protein，MRP）、鋅指蛋白（ZNF）等［3-5］。本研究通過qPCR檢測(cè)各組胃癌細(xì)胞SGC7901耐藥相關(guān)基因ZNF139、MDR1、MRP的表達(dá)，結(jié)果顯示（表4），與空白對(duì)照組比較ADR組ZNF139、MDR1、MRP-1基因的表達(dá)明顯升高（（P＜0.01），表明阿霉素可通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞耐藥基因的表達(dá)導(dǎo)致化療失敗。與空白對(duì)照組相比ADR+LNT組MRP-1基因的表達(dá)明顯降低，與ADR組相比ADR+LNT組ZNF139、MRP-1基因的表達(dá)明顯降低（（P＜0.01），MDR1表達(dá)有降低趨勢(shì)但無顯著性差異，表明香菇多糖與ADR聯(lián)合應(yīng)用可抑制SGC7901/ADR細(xì)胞多藥耐藥相關(guān)基因ZNF139、MRP-1的表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究初步表明香菇多糖可抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖，與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)SGC7901細(xì)胞凋亡，亦可抑制胃癌SGC7901細(xì)胞耐藥基因ZNF139、MRP-1的表達(dá)而逆轉(zhuǎn)化療中對(duì)阿霉素耐藥的發(fā)生。