袁 夢(mèng)，胡 莎，葛文靜

（青島市糧油質(zhì)量檢測(cè)和軍隊(duì)糧油供應(yīng)中心，山東青島 266042）

真菌毒素廣泛的存在于食品和飼料中，全球都普遍面臨著真菌毒素污染的重大問(wèn)題，嚴(yán)重威脅著人類和動(dòng)物的生命安全[1-2]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）是一種是單端孢霉烯族毒素，具有較強(qiáng)的熱抵抗力和耐酸性[3]，食用了DON污染的食物后，可對(duì)人和動(dòng)物的腸道、大腦及神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒害作用，使動(dòng)物產(chǎn)生厭食和嘔吐反應(yīng)等急性中毒癥狀[4]，嚴(yán)重時(shí)損害造血系統(tǒng)造成死亡[5-7]，因此DON又稱嘔吐毒素[8-11]。

測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)。測(cè)量不確定度通常包括很多分量[12]。其中一些分量是具有統(tǒng)計(jì)性的，另一些分量是具有非統(tǒng)計(jì)性的。為得到準(zhǔn)確、可靠和科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，不確定度的評(píng)定具有重要作用。DON含量的定量分析結(jié)果應(yīng)包括測(cè)量值和測(cè)量不確定度，能更準(zhǔn)確地反映脫氧雪腐鐮刀烯醇的濃度。本次實(shí)驗(yàn)采用《糧油檢驗(yàn) 主要谷物中16種真菌毒素的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（LS/T 6133—2018）[13]測(cè)定小麥中DON的含量，參照《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）[14]，建立DON不確定度的評(píng)定方法，分析在檢測(cè)過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度分量[15-16]，對(duì)各分量進(jìn)行計(jì)算得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度、擴(kuò)展不確定度，以及各分量的相對(duì)貢獻(xiàn)，能夠?yàn)楦鼫?zhǔn)確、科學(xué)的評(píng)定檢測(cè)結(jié)果提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1290-6460 超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；DT300A百分之一分析天平（江蘇省意歐儀器儀表有限公司）；3-18ks離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；C18色譜柱（Agilent公司，100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。

DON標(biāo)準(zhǔn)液濃度（濃度為100.6 μg/mL，不確定度為1.2 μg/mL，Pribolab公司）；13C15-脫氧雪腐鐮刀烯醇同位素內(nèi)標(biāo)（13C15-Deoxynivalenol，13C15-DON，濃度為25 μg/mL，不確定度為0.2 μg/mL，Pribolab公司）；乙腈、甲醇、乙酸銨、乙酸（分析純，美國(guó)Merck公司）。

樣品提取液：乙腈-水-乙酸混合液（70∶29∶1，V∶V∶V，自行配制）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀色譜條件儀器條件柱溫35 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；流速：0.20 mL/min；流動(dòng)相：A為1%乙酸溶液和5 mmol/L乙酸銨的水溶液，B為甲醇；流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.2.2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧電離源（ESI）負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：4 kV（+），3.5 kV（-）；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑流量：10 L/min；碰撞氣體：氬氣；掃描模式（scan type）：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；駐留時(shí)間：30 ms，質(zhì)譜條件參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液為乙腈-水-乙酸（35∶64.5∶0.5，V∶V∶V）混合液。

100.6 μg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)液配制得到10 μg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后經(jīng)過(guò)稀釋得到1.5 μg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)工作液，稀釋1.5 μg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)液得到一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度分別為 37.5 μg/mL、75 μg/mL、150 μg/mL、375 μg/mL和1 500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取0.8 mL的13C15-DON內(nèi)標(biāo)液于10 mL容量瓶中，定容至刻度線，得到2 μg/mL的13C15-DON同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.4 樣品前處理

粉碎小麥樣品，過(guò)500 μm孔徑試驗(yàn)篩，混勻。準(zhǔn)確稱取5 g（精確到0.01 g）小麥樣品于50 mL離心管，加入20 mL提取液，渦旋或振蕩提取30 min，然后用離心機(jī)6 000 r/min離心10 min，吸取0.5 mL上清液于1.5 mL離心管中，加入0.5 mL超純水，旋渦混勻，在4 ℃以下12 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.2 μm的聚四氟乙烯濾膜，收集濾液A。

1.2.5 添加13C15-DON同位素內(nèi)標(biāo)液

準(zhǔn)確吸取180 μL濾液A或者標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線于進(jìn)樣小瓶中，加入20 μL之前配制好的13C15-DON同位素內(nèi)標(biāo)工作液，旋渦混勻，上機(jī)待測(cè)。

1.2.6 樣品檢測(cè)與計(jì)算

按照上述方法以及儀器條件測(cè)定樣品，經(jīng)過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀上機(jī)檢測(cè)，以DON系列標(biāo)準(zhǔn)工作液各點(diǎn)濃度與13C15-DON內(nèi)標(biāo)液濃度之比為橫坐標(biāo)（x軸），以DON系列標(biāo)準(zhǔn)工作液各濃度的峰面積與13C15-DON內(nèi)標(biāo)液的峰面積之比為縱坐標(biāo)（y軸），以各個(gè)數(shù)值點(diǎn)做最小二乘線性擬合做工作曲線（1）：

按式（2）計(jì)算待測(cè)樣品中DON濃度：

式中：X-待測(cè)樣品中DON含量，單位為μg/kg；x-待測(cè)樣品溶液中待測(cè)毒素與內(nèi)標(biāo)的濃度比；r-待測(cè)毒素對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)濃度，單位為μg/kg；V-加入提取液的體積，20 mL；f-提取液稀釋因子，為2；m-待測(cè)樣品稱量質(zhì)量，單位為g。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量不確定度的來(lái)源分析

根據(jù)CNAS-GL006-2019化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南，上述數(shù)學(xué)模型和檢測(cè)方法操作步驟，測(cè)定小麥中DON的不確定度來(lái)源于以下幾個(gè)方面：待測(cè)樣品檢測(cè)重復(fù)性引入的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液配制過(guò)程引入的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液擬合產(chǎn)生的不確定度；樣品制備前處理過(guò)程中引入的不確定度；內(nèi)標(biāo)引入的不確定度；檢測(cè)方法及儀器設(shè)備引入的不確定度。

2.2 各不確定度分量的分析和評(píng)定

2.2.1 重復(fù)檢測(cè)引入的不確定度評(píng)定

重復(fù)檢測(cè)引入的不確定度屬于A類不確定度。實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)，無(wú)法將所有的樣品進(jìn)行前處理，這就會(huì)引起檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確，因此只能通過(guò)混勻粉碎混勻，盡量確保樣品的均勻性，增加檢驗(yàn)次數(shù)，盡量減少樣品的不均勻性引起的實(shí)驗(yàn)誤差。為了評(píng)定重復(fù)性檢測(cè)的不確定度分量，分別稱取6份小麥樣品，經(jīng)過(guò)前處理上機(jī)檢測(cè)計(jì)算得到質(zhì)控樣品的濃度，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 DON樣品重復(fù)測(cè)定數(shù)據(jù)

6個(gè)試樣測(cè)定結(jié)果平均值=1 930 μg/kg，單次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

n=6，重復(fù)性檢測(cè)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

因此，重復(fù)測(cè)定帶來(lái)的平均值相對(duì)不確定度為：

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度評(píng)定

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度來(lái)源主要包括標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度、配置系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液時(shí)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度、不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液純度引入的不確定度評(píng)定。經(jīng)查本次實(shí)驗(yàn)使用的DON標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)品證書(shū)，DON標(biāo)準(zhǔn)液濃度 為 100.6 μg/mL， 其 擴(kuò) 展 不 確 定 度 為 1.2 μg/mL（ 包 含因子k=2），則標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)不確定度為 （ub-1）=

（2）配制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液時(shí)產(chǎn)生的不確定度評(píng)定。用1.00 mL移液管移取1.00 mL的100.6 μg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL容量瓶，定容至刻度線，得到10 μg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用有1 mL移液槍分兩次移取1.5 mL的DON標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶，定容至刻度線，得到1.5 μg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別移取2.5 mL、1 mL、0.5 mL、0.25 mL的1.5 μg/mL DON標(biāo)準(zhǔn)工作液標(biāo)準(zhǔn)液到10 mL容量瓶中，分別得到 37.5 μg/L、75 μg/L、150 μg/L、375 μg/L和1 500 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)液。經(jīng)查10 mL容量瓶20 ℃時(shí)最大允誤u=0.020 mL，1 mL移液管20 ℃時(shí)最大允差為u=0.008 mL，1 mL移液槍20 ℃時(shí)相對(duì)最大允許誤差為u=1%，配制過(guò)程不同移液器相對(duì)不確定度見(jiàn)表4。

表4 使用不同量程移液器的相對(duì)不確定度表

配制好工作液標(biāo)準(zhǔn)曲線，用200 μL的移液槍取180 μL的標(biāo)準(zhǔn)液和 20 μL 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液，200 μL 的 20 ℃ 時(shí)最大允 誤 （u200 μL）=1.5%，（u20 μL）=4.0%，重 復(fù)操作5次，配制一個(gè)含內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

因此，配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液帶入的不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度為：

（3）不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合產(chǎn)生的不確定度評(píng)定。按照方法對(duì)不同濃度的DON系列標(biāo)準(zhǔn)液共檢測(cè)5次，根據(jù)表5，測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合得到線性方程y=1.034 24x+0.036 26，相關(guān)系數(shù)R=0.999 97，參與標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)n=5，標(biāo)準(zhǔn)曲線的重心（2.137 5，2.246 9），即

表5 內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量值與理論值對(duì)應(yīng)關(guān)系表

殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

待測(cè)樣品上機(jī)檢測(cè)6次，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測(cè)樣品平均DON濃度為，則通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

SR為殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差，b為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程斜率，p為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定總次數(shù)，n為待測(cè)樣品液測(cè)定次數(shù)，為待測(cè)樣品液與內(nèi)標(biāo)濃度之比的平均值； 為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度濃度與內(nèi)標(biāo)濃度之比平均值；ci為標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點(diǎn)濃度與內(nèi)標(biāo)濃度之比；計(jì)算得到u=0.012 05，因此相對(duì)不確定度為

2.2.3 樣品制備過(guò)程中引入的不確定度評(píng)定

（1）待測(cè)樣品稱量過(guò)程引入的不確定度。本實(shí)驗(yàn)采用百分之一天平稱取樣品5 g，經(jīng)查天平的計(jì)量檢定證書(shū)得到最大允差為0.5e，其中e=0.1 g，因此最大允差為0.05 g，標(biāo)準(zhǔn)不確定度相對(duì)不確定度

（2）待測(cè)樣品前處理過(guò)程中移液槍引入的不確定度評(píng)定。待測(cè)樣品前處理過(guò)程中使用5 mL移液槍4次，5 mL移液槍20 ℃時(shí)最大允許誤差為u=0.6%，相對(duì)不確定度使用1 mL移液槍2次，1 mL移液槍20 ℃時(shí)相對(duì)最大允許誤差為相對(duì)不確定度（矩

待測(cè)樣品稱量制備前處理過(guò)程產(chǎn)生的相對(duì)不確定度：

2.2.413C15-DON同位素內(nèi)標(biāo)引入的不確定度評(píng)定

經(jīng)查13C15-DON同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品證書(shū)得到擴(kuò)展不確定度u=0.2 μg/mL，k=2，同位素內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度（u內(nèi)）同位素內(nèi)標(biāo)的相對(duì)不確定度

配制2 μg/mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液，1 mL移液槍取0.8 mL內(nèi)標(biāo)液與10 mL容量瓶，此過(guò)程相對(duì)不確定度

13C15-DON同位素內(nèi)標(biāo)引入的相對(duì)不確定度（u5）=

2.2.5 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀引入的不確定度評(píng)定

經(jīng)查高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀儀器計(jì)量鑒定認(rèn)證證書(shū)，儀器的擴(kuò)展不確定度是u=11%，k=2，因此此儀器的相對(duì)不確定度

2.3 內(nèi)標(biāo)法測(cè)定小麥中DON含量的合成不確定度

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀內(nèi)標(biāo)法測(cè)定小麥中DON的不確定度分量包括重復(fù)檢測(cè)引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度、樣品制備過(guò)程中引入的不確定度、DON同位素內(nèi)標(biāo)引入的不確定度、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀引入的不確定度。合成DON含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

各不確定度分量對(duì)合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定的相對(duì)貢獻(xiàn)大小見(jiàn)表6。

表6 不確定度分量的相對(duì)貢獻(xiàn)

由表4可知，儀器引入的不確定度相對(duì)貢獻(xiàn)最大，其次是配制標(biāo)曲、樣品前處理過(guò)程、重復(fù)性檢測(cè)、同位素內(nèi)標(biāo)引入的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合引入的不確定度最小。

取置信水平為95%，k=2，因此擴(kuò)展不確定度為U=k×u×c=2×0.066 40×1 930=256 ug/kg。高效液相 - 質(zhì)譜聯(lián)用儀內(nèi)標(biāo)法測(cè)定小麥中DON的含量結(jié)果為（1 930±256）μg/kg（k=2）。

3 結(jié)論

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀內(nèi)標(biāo)法測(cè)定小麥中DON含量的不確定度評(píng)定最終結(jié)果表示為（1 930±256）μg/kg（k=2），擴(kuò)展不確定度為256 μg/kg。本次測(cè)定過(guò)程的不確定度分量中，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀引入的不確定度分量為0.055 00，對(duì)合成不確定度的影響最大，其次是配制標(biāo)曲、樣品前處理過(guò)程、重復(fù)性檢測(cè)、同位素內(nèi)標(biāo)引入，而標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合引入的不確定度分量為對(duì)結(jié)果的影響最小。