熊 偉，朱成新，王玉婷，鄭 媛，劉 琳，莫蓓莘

1) 深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東省植物表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518071；2)深圳大學(xué)龍華生物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究院，廣東深圳 518110；3)深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院，光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060

當(dāng)核糖體在信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid, mRNA)鏈上延伸遇到終止密碼子(UAA、 UAG或UGA)時(shí)，蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程會(huì)在此終止，終止密碼子的識(shí)別反應(yīng)需要兩類(lèi)釋放因子(release factor, RF)參與：在原核生物中，特異性釋放因子為RF1和RF2，非特異性釋放因子為RF3；在真核生物中，特異性釋放因子RF為真核生物釋放因子1(eukaryotic release factor 1, ERF1)，其直接與終止密碼子作用，非特異性釋放因子為ERF3，其既可作為運(yùn)載蛋白也可促進(jìn)第1類(lèi)肽鏈釋放因子的生物活性[1-6]. 翻譯終止過(guò)程中由ERF1和ERF3共同介導(dǎo)完成，ERF1在核糖體A位點(diǎn)識(shí)別終止密碼子后與該位點(diǎn)結(jié)合，從而終止蛋白質(zhì)的翻譯，ERF3通過(guò)水解三磷酸鳥(niǎo)苷(guanosine triphosphate, GTP)的方式來(lái)促進(jìn)此反應(yīng)[7-8]. ERF1是由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的在空間結(jié)構(gòu)上模擬轉(zhuǎn)運(yùn)RNA( transport RNA, tRNA)的蛋白因子：結(jié)構(gòu)域1類(lèi)似于tRNA反密碼子的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)高保真終止密碼子的識(shí)別；結(jié)構(gòu)域2可以刺激核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶中心(peptidyl transferase center, PTC)的水解活性并釋放新生多肽，該模塊包含高度保守的甘氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺(glycine-glycine-glutamine, GGQ)模塊；結(jié)構(gòu)域3負(fù)責(zé)連接ERF3[9-12].

ERF1基因在真核生物中高度保守，不同物種之間ERF1蛋白質(zhì)序列同源性高達(dá)50%以上[12-13]. 將來(lái)源于非洲爪蟾、人類(lèi)、兔子和敘利亞倉(cāng)鼠等物種的ERF1基因異源表達(dá)在酵母ERF1基因缺失突變株中，均能恢復(fù)酵母正常生長(zhǎng)表型，說(shuō)明不同物種ERF1基因的功能也高度保守[14-17]. 在大多數(shù)真核生物中，ERF1基因以單拷貝的形式存在，而在模式植物擬南芥中ERF1基因有高度同源的3個(gè)拷貝：ERF1-1、ERF1-2和ERF1-3， 擬南芥中的3個(gè)ERF1基因均有表達(dá)且都具有生理功能[18]. 有研究報(bào)道，在擬南芥中表達(dá)ERF1-1基因會(huì)觸發(fā)共抑制(cosuppression)，導(dǎo)致ERF1-1、ERF1-2和ERF1-3的表達(dá)量均下降，從而產(chǎn)生嚴(yán)重的發(fā)育缺陷表型[19]. 研究發(fā)現(xiàn)，erf1-2突變體對(duì)葡萄糖和植物激素的響應(yīng)發(fā)生變化[20]. 盡管已取得一些研究成果，但是人們對(duì)ERF1基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用仍然了解得很少.

為研究ERF1-1基因的功能，采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)擬南芥ERF1-1基因進(jìn)行了敲除，觀察不同突變形式的erf1-1突變體在正常生長(zhǎng)條件下的表型.

1 材料和方法

1.1 植株生長(zhǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)所用的擬南芥為野生型Col-0，先后用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精及體積分?jǐn)?shù)為6%的次氯酸鈉將種子消毒洗凈，均勻播撒在1/2 Murashige和Skoog(MS)固體培養(yǎng)基，置于4 ℃冰箱24 h以打破種子休眠；然后在光照恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周，待其長(zhǎng)成幼苗，移栽于營(yíng)養(yǎng)土(V(泥土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=3∶3∶1)中，置于植物房培養(yǎng)．恒溫培養(yǎng)箱與植物房的培養(yǎng)條件設(shè)置相同：22 ℃，光周期為16 h/8 h(光照/黑暗)，光照強(qiáng)度為8 000 lx.

采用中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)陳其軍課題組開(kāi)發(fā)的胚胎特異性啟動(dòng)子表達(dá)CAS9蛋白的CRISPR-Cas9系統(tǒng)[21]對(duì)ERF1-1(AT5G47880)進(jìn)行基因敲除. 首先在http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html網(wǎng)站系統(tǒng)上根據(jù)原間隔序列鄰近模塊序列(protospacer adjacent motif, PAM)特異性在ERF1-1基因編碼區(qū)外顯子上下游各挑選一個(gè)靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)向?qū)Ш颂呛怂?guide ribonucleic acid, gRNA)序列(圖1和表1). 間隔序列為長(zhǎng)20核苷酸(nucleotide, nt)的gRNA間隔序列對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)序列，與目的基因的某一段序列互補(bǔ)；PAM序列是CAS9蛋白的切割位點(diǎn).

圖1 ERF1-1 (AT5G47880 )基因結(jié)構(gòu)及gRNA設(shè)計(jì)位點(diǎn)示意圖(ERF1-1基因編碼區(qū)無(wú)內(nèi)含子)Fig.1 Diagram of the gene structure of ERF1-1 (AT5G47880 ) and the designed gRNA sites (ERF1-1 gene has no intron)

表1 ERF1-1 基因CRISPR-Cas9靶點(diǎn)選擇及gRNA序列Table 1 The sequences of gRNA in ERF1-1 gene and the target sites for CRISPR-Cas9

1.3 載體構(gòu)建

將稀釋100倍的pCBC-DT1T2質(zhì)粒作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)模板，以DT1-BsF、DT2-BsR、DT1-F0和T2-R0為擴(kuò)增引物(表2)，獲取ERF1-1基因CRISPR-Cas9靶點(diǎn)序列PCR產(chǎn)物．將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的1.5 mL離心管，先在37 ℃放置5 h，進(jìn)行BsaI酶切；酶切產(chǎn)物同時(shí)與pHEE401質(zhì)粒連接，于50 ℃放置5 min；最后于80 ℃放置10 min，使離心管中所有酶失活.將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)．將篩選到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒.將重組的pHEE401質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株.

1.4 農(nóng)桿菌侵染擬南芥染花序

將轉(zhuǎn)有pHEE401質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101在液體Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(含抗生素利福平、卡那霉素和慶大霉素)中，于28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)36 h．離心收集培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌，采用菌體重懸液(1 L去離子水+30 g蔗糖+200 μL表面活性劑Silwet77)混勻，然后將擬南芥花序持續(xù)浸沒(méi)其中達(dá)3 min后，保鮮膜包裹植株，避光培養(yǎng)2 d，最后放入光照充足的溫室(22 ℃)中培養(yǎng).

1.5 測(cè) 序

植物核酸提取方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[22-23]．本研究所涉及到的測(cè)序結(jié)果均由廣州艾基生物技術(shù)有限公司提供，獲取的ERF1-1 CRISPR-Cas9靶點(diǎn)序列的PCR產(chǎn)物測(cè)序引物為U626-IDF和U629-IDF，各突變株DNA敲除結(jié)果的測(cè)序驗(yàn)證引物為Sense和ANTI(表2).

表2 引物序列及用途1)

2 結(jié)果與分析

2.1 ERF1家族成員蛋白質(zhì)序列高度保守

在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)上搜索ERF1基因，發(fā)現(xiàn)擬南芥基因組中有3個(gè)基因編碼ERF1，分別被命名為ERF1-1(AT5G47880)、ERF1-2(AT1G12920)和ERF1-3(AT3G26618)．這3個(gè)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量均為435個(gè)，序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，它們彼此之間高度同源(圖2)，其中，ERF1-1與ERF1-2蛋白之間氨基酸序列同一性為85.7%，ERF1-1與ERF1-3蛋白之間氨基酸序列同一性為85%，而ERF1-2與ERF1-3蛋白之間氨基酸序列同一性高達(dá)94.2%(表3)，這些分析結(jié)果表明，ERF1家族成員蛋白質(zhì)序列高度保守，暗示它們?cè)诠δ苌峡赡軙?huì)存在冗余性.

圖2 ERF1家族蛋白序列比對(duì)Fig.2 Protein sequence alignments of ERF1 family members

表3 ERF1-1、ERF1-2和ERF1-3蛋白序列之間氨基酸序列同一性統(tǒng)計(jì)

2.2 ERF1-1基因CRISPR/Cas9編輯位點(diǎn)分析

通過(guò)測(cè)序鑒定了ERF1-1基因發(fā)生突變的位點(diǎn)．發(fā)現(xiàn)獲得ERF1-1突變株的突變類(lèi)型有4種：?jiǎn)螇A基插入、單堿基缺失、單堿基替換以及雙堿基替換(表4).gRNA1靶向的位點(diǎn)及gRNA2靶向的位點(diǎn)均有編輯發(fā)生，遺憾的是本研究并未鑒定到大片段缺失突變株.單堿基插入突變中，gRNA1位點(diǎn)存在兩種突變形式，gRNA2也存在兩種突變形式；單堿基缺失突變中，僅在gRNA2位點(diǎn)發(fā)生堿基G的缺失；單間堿基替換突變中，僅在gRNA1位點(diǎn)發(fā)生堿基C替換成堿基G、堿基A替換成堿基G；而雙堿基突變中同樣是gRNA1位點(diǎn)發(fā)生堿基CC替換成堿基GT.根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果及測(cè)序峰圖，以上所列出的突變形式均得到了純合突變植株.

2.3 erf1-1純合突變體表型觀察

將獲得的各種類(lèi)型的純合突變體種植在1/2 MS固體培養(yǎng)基上，然后在22 ℃光照恒溫培養(yǎng)箱(光周期為16 h/8 h(光照/黑暗)，光照強(qiáng)度為8 000 lx)培養(yǎng)以觀察表型.如圖3，培養(yǎng)到第11天的erf1-1純合突變體與野生型相比僅有微弱的表型差異——植株稍大，蓮座葉葉片輕微上翹，erf1-1純合突變體成苗株高與野生型相比差別不大.所有的單堿基插入或缺失突變體均觀察到同樣的表型，說(shuō)明觀察的微弱的生長(zhǎng)發(fā)育缺陷表型缺失確實(shí)是由于ERF1-1突變導(dǎo)致的.

表4 ERF1-1基因編輯位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)

圖3 erf1-1純合突變體第11天表型Fig.3 Phenotypes of 11-day old plants of erf1-1 mutants homozygous

3 討 論

翻譯終止是蛋白質(zhì)在核糖體中合成中重要的一環(huán)，而釋放因子EF則是翻譯終止過(guò)程中新生肽鏈釋放過(guò)程中的關(guān)鍵因素.目前，對(duì)于酵母和人類(lèi)來(lái)源ERF1蛋白的研究比較多，且在酵母中ERF1翻譯終止作用已被證實(shí)，而在植物中對(duì)ERF1蛋白的功能研究有限[24]. 在擬南芥中使用35S啟動(dòng)子去表達(dá)ERF1-1基因時(shí)會(huì)引發(fā)共抑制，導(dǎo)致ERF1基因家族的3個(gè)成員表達(dá)量都下降.ERF1家族基因發(fā)生共抑制會(huì)嚴(yán)重影響植株的表型，例如導(dǎo)致花序成掃帚狀，節(jié)間伸長(zhǎng)減少等[24]．

在ABRC擬南芥生物資源保藏中心，ERF1家族中ERF1-2和ERF1-3均可直接獲得T-DNA插入突變體，而ERF1-1則沒(méi)有相應(yīng)資源．為進(jìn)一步探究擬南芥ERF1-1基因的功能，本研究利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)擬南芥的ERF1-1基因進(jìn)行高效率的編輯，共得到ERF1-1基因的8種不同編輯形式(表3)，其中，4種為單堿基插入，1種為單堿基缺失，3種為堿基替換．單堿基插入或缺失均會(huì)導(dǎo)致讀碼框移碼，造成無(wú)意突變，即對(duì)ERF1-1基因形成了有效敲除.

在正常生長(zhǎng)條件下，erf1-1突變植株并沒(méi)有顯著生長(zhǎng)發(fā)育缺陷表型，形態(tài)與野生型相差不大，只是植株稍微比野生型大且葉片邊緣輕微往上翹.推測(cè)ERF1-1、ERF1-2和ERF1-3功能冗余，在erf1-1突變植株中ERF1-2和ERF1-3基因繼續(xù)發(fā)揮功能，ERF1基因家族的功能受影響較小，因此，erf1-1單突變表型并不明顯.

結(jié) 語(yǔ)

mRNA翻譯成蛋白質(zhì)翻譯結(jié)束步驟中，新生多肽鏈的釋放需要釋放因子ERF1的參與.本研究采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)靶向突變了模式植物擬南芥中ERF1基因家族中的ERF1-1基因，獲得了眾多不同突變位點(diǎn)的erf1-1突變植株，這些突變體植株在正常生長(zhǎng)條件下只有輕微生長(zhǎng)發(fā)育缺陷表型，據(jù)此結(jié)果推測(cè)，ERF1基因家族成員之間可能功能冗余.erf1-1單基因突變是否會(huì)對(duì)各種不同的生物脅迫和非生物脅迫有響應(yīng)則需要設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證．本研究所獲得的erf1-1單基因突變體材料將為探究其生物學(xué)功能提供重要遺傳學(xué)基礎(chǔ).