高 琳，費 靜，劉 毅，李曉紅

1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院健康管理中心（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（瀘州 646000）

下咽鱗癌是一種原發(fā)于下咽部且侵襲性高的頭頸部惡性腫瘤，由于其發(fā)病位置隱匿且癥狀不典型，大部分患者就診時已為晚期[1]。一直以來，對下咽鱗癌早期診斷及治療缺乏有效的治療手段，手術(shù)、放療和化療是其主要治療方式[2]，導(dǎo)致患者術(shù)后的整體生存情況并不理想，因此亟需新的理念及治療藥物來改善現(xiàn)狀。

隱丹參酮（cryptotanshinone，CPT）是傳統(tǒng)中藥丹參中的主要脂溶性成分，具有抗炎、抗氧化等多種藥理作用[3-4]。而近年來，CPT 被報道可抑制肝癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞增殖，阻礙腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性[5-8]。但目前并無CPT 作用于下咽鱗癌的研究報道。本研究以人下咽鱗癌細胞FaDu 為研究對象，探討CPT對FaDu細胞增殖及遷移的影響。

1 材料

1.1 細胞

人下咽鱗癌細胞FaDu，購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.2 藥物及試劑

隱丹參酮，胎牛血清（Biological Industries），高糖DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone），0.25%胰蛋白酶（含EDTA，Thermo Fisher），RIPA 強裂解液（Beyotime），Transwell 小室（24 孔8.0um，Corning），CDK4、Cyclin D、GAPDH抗體（Proteintech），Vimentin抗體（Servicebio），AKT抗體（ZEN-BIO），p-AKT抗體（Beyotime）。

1.3 儀器

倒置熒光顯微鏡（Olymplus，日本）；全光譜分光光度計（Thermo Fisher，美國）；電泳儀、垂直電泳槽（Bio-Rad，美國）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

人下咽鱗癌細胞FaDu 常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，待細胞長至90%密度左右時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，并進行后續(xù)實驗。

2.2 CCK-8實驗

參照CCK-8試劑盒（Beyotime）操作。

2.3 克隆形成實驗

在6 孔培養(yǎng)板中每孔接種1 000 個FaDu 細胞，加入含CPT 的新鮮高糖DMEM 培養(yǎng)基處理24 h 后，換成新鮮高糖DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。7 d 后用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色后進行拍照。

2.4 劃痕實驗

在6 孔培養(yǎng)板中每孔接種6×105個FaDu 細胞，第2 d用黃槍頭垂直于孔底進行劃痕。加入含CPT的新鮮無血清高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，拍照分析。

2.5 Transwell遷移實驗

將Transwell小室放入24孔板中，在每個上室中加入含F(xiàn)aDu細胞的無血清高糖DMEM培養(yǎng)基，向每個下室中加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下對小室下層的細胞進行拍照計數(shù)。

2.6 蛋白印跡（Western blot）實驗

收集不同濃度CPT處理的細胞，加入RIPA強裂解液提取蛋白，再利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜，一抗4 ℃孵育過夜，HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h后，通過ECL化學(xué)發(fā)光于凝膠成像系統(tǒng)中成像。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CPT抑制FaDu細胞增殖

CCK-8實驗檢測CPT對FaDu細胞增殖的影響，見圖1。與對照組（DMSO 組）相比，不同濃度的CPT（2.5 μM、5 μM、10 μM、20 μM）作用于人下咽鱗癌細胞FaDu 24 h、48 h 及72 h 后，表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。隨CPT 濃度的增加，對FaDu 細胞增殖的抑制作用逐漸增強，且呈現(xiàn)濃度和時間的依賴性關(guān)系，見表1。各加藥濃度組與對照組（DMSO組）相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。同時CPT 對FaDu 細胞在24 h、48 h 及72 h 的半數(shù)致死劑量IC50 分別為15.42 μM、6.49 μM、3.46 μM。

表1 不同濃度CPT處理后各組細胞的相對存活率

3.2 CPT抑制FaDu細胞克隆形成

細胞克隆形成實驗分析CPT 對FaDu 細胞克隆形成的影響，見圖2。與對照組（DMSO組）相比，不同濃度的CPT（2.5 μM、5 μM、10 μM）對人下咽鱗癌細胞FaDu克隆形成能力表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。隨CPT濃度的增加，對FaDu細胞克隆形成的抑制作用越來越強（圖1）。統(tǒng)計各組細胞克隆形成的數(shù)量并計算各組的克隆形成率，各組的克隆形成率分別為DMSO 組（67.0% ± 4.9%）、CPT 2.5 μM 組（30.1% ±1.8%）、CPT 5 μM 組（13.2%±3.3%）、CPT 10 μM 組（7.5%±2.2%），各加藥濃度組與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且單因素方差分析表明F=197.504，P＜0.001。

圖1 CPT對FaDu細胞克隆形成能力的影響

3.3 CPT抑制FaDu細胞遷移

細胞劃痕實驗與Transwell遷移實驗分析CPT對FaDu 細胞遷移能力的影響（圖3）。細胞劃痕實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)CPT 能明顯抑制人下咽鱗癌細胞FaDu 劃痕愈合能力，且隨CPT濃度的增加，其抑制作用越來越強（圖2）。統(tǒng)計各組24 h 后的細胞愈合率，DMSO 組84.5%±3.8%、CPT 2.5 μM組65.3%±1.3%、CPT 5 μM組39.5%±2.1%、CPT 10 μM 組12.6%±3.2%，各加藥濃度組與對照組（DMSO組）相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且單因素方差分析表明F=388.287，P＜0.001。。Transwell 遷移實驗結(jié)果表明CPT 能明顯抑制人下咽鱗癌細胞FaDu遷移能力，且隨CPT濃度的增加，其抑制作用越來越強（圖3）。與對照組（DMSO組）相比各組的相對細胞遷移率為：DMSO 組（100%± 4.0%）、CPT 2.5 μM 組（77.2% ± 3.7%）、CPT 5 μM組（44.8%±4.2%）、CPT 10 μM 組（10.0%±1.4%），各加藥濃度組與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且單因素方差分析表明F=375.848，P＜0.001。

圖2 細胞劃痕實驗檢測CPT對FaDu細胞遷移能力的影響

圖3 Transwell遷移實驗檢測CPT對FaDu細胞遷移能力的影響

3.4 CPT抑制FaDu細胞周期及遷移相關(guān)蛋白的表達

為進一步闡明CPT 調(diào)控FaDu 細胞增殖和遷移的分子機制，采用Western blot 檢測不同濃度的CPT處理FaDu細胞后細胞周期相關(guān)蛋白CDK4、Cyclin D及EMT 相關(guān)蛋白Vimentin 的表達情況。Western blot結(jié)果如圖5 所示，與對照組（DMSO 組）相比，CDK4、Cyclin D 及Vimentin 蛋白相對表達量隨CPT 濃度的增加而明顯下調(diào)。進一步灰度值分析發(fā)現(xiàn)，加藥濃度組（5 μM 組與10 μM 組）與對照組相比各蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖4）。

3.5 CPT抑制AKT蛋白的表達

AKT 蛋白作為PI3K/AKT 信號通路核心蛋白，經(jīng)磷酸化激活形成p-AKT 后可進一步調(diào)控下游細胞周期相關(guān)蛋白CDK4、Cyclin D 及EMT 相關(guān)蛋白Vimentin的表達，參與細胞增殖及轉(zhuǎn)移的調(diào)控。通過Western blot 檢測不同濃度CPT 處理FaDu 細胞后AKT蛋白的表達，結(jié)果顯示AKT及p-AKT蛋白相對表達量隨CPT 濃度的增加而明顯下調(diào)。進一步灰度值分析發(fā)現(xiàn)，各加藥濃度組與對照組相比各蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖4）。

圖4 Western blot檢測不同濃度CPT處理FaDu細胞后相關(guān)蛋白的表達變化

4 討論

下咽癌是一種少見的頭頸部惡性腫瘤，約占頭頸部惡性腫瘤的3%～5%，其病理類型以鱗狀細胞癌為主[9-10]。由于早期下咽癌的癥狀與體征并不明顯，70%～85%的患者在確診時已處于Ⅲ期或Ⅳ期，且極易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后差、生存率低[11-12]。盡管對下咽癌的手術(shù)治療、放療、化療及靶向藥物治療取得了重要進展，但下咽癌患者的預(yù)后尚無明顯改善[13]。因此，有必要尋找與下咽癌治療進展相關(guān)的新策略。

隱丹參酮（cryptotanshinone，CPT）作為一種從丹參中提取的天然化合物，目前研究表明其除在心血管疾病及神經(jīng)退行性疾病中表現(xiàn)出良好的治療前景[14-16]，在多種腫瘤（如肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等）中也顯示出較好的抗腫瘤活性[17-22]。Luo等[23]研究發(fā)現(xiàn)，CPT可抑制肝癌細胞異種移植瘤的生長，且其對肝癌的抗腫瘤機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路后引起的細胞凋亡和自噬有關(guān)。黃等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，CPT能有效抑制胰腺癌細胞的生長和遷移，其作用機制可能與其下調(diào)AKT 的表達，并進一步導(dǎo)致胰腺癌細胞生長周期阻滯及抑制EMT過程有關(guān)。Zhang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，CPT通過調(diào)節(jié)MMP/TIMP系統(tǒng)、PI3K/AKT/mTOR信號和HIF-1α核易位，抑制炎癥和腫瘤血管生成來抑制結(jié)腸癌的生長和侵襲。Jin L等[26]研究發(fā)現(xiàn)，CPT通過促進TAZ從核向細胞質(zhì)的易位減弱非小細胞肺癌細胞的干性，揭示其作為非小細胞肺癌輔助治療的可能性。

本研究發(fā)現(xiàn)，CPT 能夠抑制人下咽癌細胞FaDu的增殖及遷移能力，且抑制作用呈藥物濃度依賴性增強。通過進一步檢測CPT對PI3K/AKT信號通路核心蛋白AKT 蛋白的影響，結(jié)果表明CPT 可明顯抑制總AKT及p-AKT的表達。本研究表明CPT在下咽癌中表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性，其作用機制可能與其下調(diào)AKT 的表達，并進一步下調(diào)細胞周期蛋白（CDK4 及Cyclin D）及上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白（Vimentin）的表達有關(guān)。

5 結(jié)論

CPT 能明顯抑制人下咽癌細胞FaDu 的增殖及遷移，其抑制作用可能是通過下調(diào)PI3K/AKT信號通路核心蛋白AKT蛋白的表達來實現(xiàn)，但其確切的調(diào)控機制還需進一步的研究。本研究為CPT 用于下咽癌患者的治療提供了依據(jù)，為其作為抗下咽癌藥物的后續(xù)開發(fā)奠定基礎(chǔ)。