楊 清，李愛玲，王天雄，李明珂，冉浩龍，湯 艷

1.西南醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（瀘州 646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院（瀘州 646000）

據(jù)《2018年全球癌癥統(tǒng)計》報道，2018年有1 810萬新發(fā)癌癥病例和960萬死亡癌癥病例[1]，癌癥將成為世界上每個國家/地區(qū)死亡人數(shù)增加的首要原因和期望壽命增加最重要的障礙[2]。隨著基因組測序的發(fā)展，越來越多的非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA）被人類發(fā)現(xiàn)，包括微小RNA（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）等[3-4]。

lncRNA 是一類非蛋白質(zhì)編碼的RNA 轉(zhuǎn)錄物，具有超過200 bp 的核苷酸，不具有完整的開放閱讀框，所以缺乏蛋白編碼能力[5-6]。miRNA 是一類長度為18～25個核苷酸的短的非編碼RNA，通過堿基互補配對的原則與所調(diào)控的mRNA 的3'端非翻譯區(qū)（3'UTR）發(fā)生配對，形成種子序列（5'端2～8 位核苷酸序列）[3，7-8]，在轉(zhuǎn)錄后通過抑制mRNA 翻譯或誘導(dǎo)mRNA 降解調(diào)控基因表達。隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究不斷深入，lncRNA 和miRNA 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的相互作用越來越受到重視，兩者共同表達，能協(xié)同調(diào)控靶基因而影響癌癥的進程[9]。

到目前為止，對lncRNA 和miRNA 的相互作用進行了許多闡述，但是否存在相關(guān)性有一定爭議，而且兩者在預(yù)后及其相關(guān)性方面沒有系統(tǒng)的報道，因此需要對這些散在證據(jù)進行綜合與評價，以提供更有利的資料作為研究參考。此次分析主要總結(jié)了與癌癥預(yù)后有關(guān)的lncRNA 和miRNA 并分析其相關(guān)性，以評價lncRNA 和miRNA 在預(yù)后及相關(guān)性方面的現(xiàn)狀。

1 資料與方法

1.1 檢索策略

相關(guān)文獻通過PubMed、Embase、Web of Science、CNKI 和Cochrane 圖書館數(shù)據(jù)庫進行檢索。檢索日期：從建庫到2020 年8 月20 日。引用的相關(guān)文獻經(jīng)過人工篩選，并在最終分析之前重新進行檢索。使用以下術(shù)語和關(guān)鍵詞進行檢索，英文檢索詞：“l(fā)ong noncoding RNA/long ncRNA/lncRNA/lincRNA/long intergenic non-coding RNA/long untranslated RNA”，“MicroRNA/miRNA/RNA，Micro or miRNA/Primary MicroRNA/pri-miRNA/stRNA/pre-miRNA”，“Neoplasms/Neoplasia/Neoplasm/Tumors/Cancer/Malignancy”；中文檢索詞：“長鏈非編碼RNA/長非編碼RNA/長鏈非編碼核糖核酸/lncRNA”，“miRNA/microRNA”，“腫 瘤/癌/Neoplasms/Neoplasia/Neoplasm/Tumors/Cancer/Malignancy”。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

入選標(biāo)準(zhǔn)：①關(guān)于lncRNA-miRNA 的相關(guān)性及其與癌癥生存預(yù)后有關(guān)的前瞻性隊列研究；②原始研究人群的癌癥組織與正常組織進行量化對比，以評價lncRNA 和miRNA 的表達水平；③報道了HR及95%CI和lncRNA-miRNA 的相關(guān)系數(shù)r；④能夠獲得全文的文章。排除標(biāo)準(zhǔn)：①綜述、信件、個案報道、重復(fù)發(fā)表的研究；②缺乏可用數(shù)據(jù)，如HR 及95%CI。

1.3 文獻篩選和數(shù)據(jù)提取

根據(jù)已制定的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，兩位研究者獨立地篩選文獻，然后評估文獻的標(biāo)題和摘要。如果從標(biāo)題和摘要無法判斷文獻是否符合要求，則閱讀全文。有任何疑問則通過和第三個研究者討論解決。數(shù)據(jù)提取由兩位研究者獨立執(zhí)行，有任何差異則通過小組討論解決。以下是從每篇文獻中提取的信息：①第一作者、出版年份及國家；②腫瘤類型、組織類型及樣本量；③lncRNA和miRNA的名稱；④lncRNA和miRNA 的表達水平；⑤lncRNA-miRNA 的相關(guān)系數(shù)r；⑥檢測方法；⑦隨訪時間和臨界值；⑧生存分析方法；⑨HR 及其相應(yīng)的95%CI。此綜述是按PRISMA聲明編寫，注冊號為CRD42020186889[10]。

1.4 偏倚風(fēng)險評估

兩位研究者獨立地完成文章的偏倚風(fēng)險評估。使用紐卡斯?fàn)?渥太華量表（the newcastle-ottawascale，NOS）對每篇文獻進行質(zhì)量評價，從研究的3個方面（選擇、可比性、結(jié)果）進行評估，滿足條件則獲得一顆星（≥6顆星都是高質(zhì)量）。

1.5 統(tǒng)計分析

使用R 4.0.2進行資料分析。合并效應(yīng)量為危險比（HR）和lncRNA-miRNA 的相關(guān)系數(shù)r，風(fēng)險比（HR）使用對數(shù)風(fēng)險比（logHR）及其對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤（SElogHR）的方法進行合并，相關(guān)系數(shù)r使用Fisher’s z變換進行效應(yīng)量的合并。采用I2統(tǒng)計量進行異質(zhì)性檢驗，I2≥50%或者P＜0.1，說明研究之間存在異質(zhì)性，應(yīng)采用隨機效應(yīng)模型分析結(jié)果，如果沒有，則采用固定效應(yīng)模型（I2＜50%或P≥0.1）。用森林圖顯示meta 分析結(jié)果，使用WHO 腫瘤分類進行亞組分析。潛在的發(fā)表偏倚使用Egger’s 檢驗進行評估，如果還存在差異則使用剪補法評價發(fā)表偏倚對結(jié)果的影響，使用敏感性分析以識別各個研究數(shù)據(jù)對HR和r匯總的影響。P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 文獻檢索結(jié)果

如圖1 所示，共檢索出5 587 篇研究，剔除重復(fù)后剩2 972 篇研究，根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)篩選，并仔細(xì)閱讀題目和摘要后剩余362 篇研究，有27 篇研究符合條件，可進一步進行分析。

圖1 文獻檢索流程圖

2.2 納入文獻特征

27 篇研究共有患者2 967 例，樣本量范圍為42～248例，這些研究發(fā)表于2016年至2020年，皆來自中國。在27 篇研究中，包括乳腺癌2 篇、消化系統(tǒng)癌癥14 篇、頭頸部癌癥5 篇、肺癌2 篇、神經(jīng)膠質(zhì)瘤2篇、骨肉瘤1 篇、黑素瘤1 篇。均采用qRT-PCR 檢測lncRNA 和miRNA 的表達量，樣本皆來源于組織，生存分析的指標(biāo)都是總體生存率（OS），與癌癥預(yù)后相關(guān)的lncRNA有27篇，有16篇表明了lncRNA和miRNA的相關(guān)性，HR及其95%CI和相關(guān)系數(shù)皆是直接從文獻報道的原始數(shù)據(jù)中提取。所有納入的研究紐卡斯?fàn)?渥太華量表（NOS）評分都是≥6 顆星，主要特征見表1。

2.3 lncRNA與總體生存率之間的關(guān)聯(lián)

綜合了27篇研究，包含了2 967例癌癥患者，其結(jié)果顯示了高表達的lncRNA 與總體生存率預(yù)后不良有相關(guān)性（圖2）。由于I2=80%（P＜0.001），故使用了隨機效應(yīng)模型，合并的HR為2.49（95%CI：2.04～3.03，P＜0.001）。通過亞組分析（圖3）顯示，在乳腺腫瘤、頭頸部腫瘤、消化道腫瘤（肝癌）、消化道腫瘤（胃癌、結(jié)直腸癌等）、肺癌和其他癌癥（神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨肉瘤等）中，lncRNA表達水平的升高與總生存率（OS）預(yù)后不良皆有關(guān)（HR=3.43，95%CI：1.93～6.09，P＜0.05；HR=2.73，95%CI：1.68～4.45，P＜0.05；HR=2.05，95%CI：1.43～2.95，P＜0.05；HR=2.57，95%CI：1.80～3.67，P＜0.05；HR=1.90，95%CI：1.49～2.43，P＜0.05；HR=2.59，95%CI：1.87～3.57，P＜0.05）。Egger’s 檢驗評價顯示此次分析（P＜0.05）存在發(fā)表偏倚。經(jīng)剪補法檢驗后（圖4），顯示合并的HR對發(fā)表偏倚沒有明顯影響，結(jié)果穩(wěn)定。敏感性分析（圖5）表明本分析是穩(wěn)定和可靠的。

圖2 lncRNA表達與總體生存率的森林圖

圖3 lncRNA表達與總體生存率的亞組分析森林圖

圖4 總體生存率的發(fā)表偏倚圖

圖5 總體生存率的敏感性分析

2.4 lncRNA與miRNA之間的關(guān)聯(lián)

從16 項符合條件的研究中收集了lncRNA 與miRNA 的相關(guān)系數(shù)r，經(jīng)過Fisher’sz變換進行效應(yīng)量r的合并，從而得到結(jié)果（圖6）。分析發(fā)現(xiàn)lncRNA與miRNA呈負(fù)相關(guān)，由于I2=79%（P＜0.001），故使用隨機效應(yīng)模型，合并的r值為-0.68（95%CI：-0.8～-0.56）。亞組分析（圖7）顯示，在乳腺腫瘤、消化道腫瘤（肝癌）、消化道腫瘤（胃癌、結(jié)直腸癌等）、頭頸部腫瘤、肺癌、其他癌癥（神經(jīng)膠質(zhì)瘤）中，lncRNA與miRNA皆呈負(fù)相關(guān)（r=-0.37，95%CI：-0.68～-0.05；r=-0.65，95%CI：-0.90～-0.39；r=-0.84，95%CI：-1～-0.62；r=-0.45，95%CI：-0.63～-0.27；r=-0.59，95%CI：-0.79～-0.40；r=-0.75，95%CI：-0.63～-0.27）。Egger’s 檢驗評估分析的發(fā)表偏倚（P=0.96），結(jié)果顯示沒有顯著的發(fā)表偏倚。敏感性分析（圖8）表明我們的分析是穩(wěn)定和可靠的。

圖6 lncRNA與miRNA相關(guān)性的森林圖

圖7 lncRNA與miRNA相關(guān)性的亞組分析森林圖

圖8 相關(guān)系數(shù)的敏感性分析

3 討論

癌癥的發(fā)生發(fā)展是一個多機制且復(fù)雜的過程，lncRNA 與miRNA 在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不可小覷的作用。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 在轉(zhuǎn)錄后和/或轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因表達，包括染色質(zhì)重塑，表觀遺傳修飾，組蛋白修飾和海綿效應(yīng)等[38]。lncRNA 在各種細(xì)胞過程（例如腫瘤發(fā)生以及轉(zhuǎn)移）中作為必要的調(diào)節(jié)因子出現(xiàn)[39]，特別是具有高度組織和發(fā)育階段特異性的表達，為癌癥的診斷和治療提供了新的可能性[40-41]。而miRNA在生物過程中起著關(guān)鍵作用，如細(xì)胞增殖、分化和凋亡等[42]。越來越多的miRNA已被證實參與促進或抑制癌癥的發(fā)生，作為癌基因或抑癌基因參與癌癥相關(guān)靶基因的表達[43-44]。且最近已有研究表明，與癌癥相關(guān)的特定lncRNA 和miRNA 可在血液和血清樣品中被檢測到[45-46]。在兩者相互作用中，有研究發(fā)現(xiàn)，在不同癌癥組織及細(xì)胞中，不同類型的lncRNA表達升高，相應(yīng)的miRNA 表達下調(diào)，從而進一步影響癌癥的進展。比如lncRNA可以通過競爭性結(jié)合miRNA，抑制miRNA表達及其對下游靶基因的負(fù)向調(diào)控作用，能抑制腫瘤增值、侵襲、遷移和促進腫瘤細(xì)胞凋亡，這無疑為癌癥治療提供了新思路和方向[47]。因此對lncRNA和miRNA之間機制的深入研究，可能為未來癌癥診斷、預(yù)后甚至是治療找到新的突破口[48]。

本次meta 分析主要是在探索lncRNA 與miRNA對癌癥預(yù)后的影響以及它們之間的相關(guān)性。本文評價了研究中的lncRNA 和miRNA，其中大部分都只被研究過一次，可提供有關(guān)lncRNA 與miRNA 對癌癥預(yù)后及其相關(guān)性的部分見解。

本研究分析表明，高表達的lncRNA是總體生存率預(yù)后不良的危險因素。在亞組分析中，相對于其他癌癥來說，乳腺腫瘤、頭頸部腫瘤中的lncRNA 表達水平的升高對OS 預(yù)后不良表現(xiàn)的更為顯著。此外，有的文章顯示了HR 作為危險因素的證據(jù)相對不足，如Cui C[33]研究表明HR 的可信區(qū)間為1.02～2.08，但經(jīng)過合并后，總體HR的準(zhǔn)確度升高，顯示了lncRNA 可能是預(yù)后差的危險因素，且研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA作為乳腺腫瘤（HR=3.43）預(yù)后不良的危險因素比肺癌（HR=1.90）的證據(jù)更強。這些研究皆是調(diào)查的lncRNA 與OS 之間的關(guān)系，且大多數(shù)都采用的是多因素分析，大多數(shù)結(jié)果都顯示了lncRNA與癌癥的總體生存率之間存在著統(tǒng)計學(xué)上的相關(guān)性，揭示了lncRNA在癌癥預(yù)后中具有一定的價值，可能作為癌癥預(yù)后的獨立預(yù)測因子，并在不同腫瘤類型中得到了體現(xiàn)，可以更有針對性的開展研究。

在lncRNA 與miRNA 的相關(guān)分析中，發(fā)現(xiàn)lncRNA與miRNA的表達主要呈負(fù)相關(guān)，且合并的r表現(xiàn)為強相關(guān)。其中在消化道腫瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤表現(xiàn)的相關(guān)性皆比其他腫瘤都要強，在乳腺腫瘤表現(xiàn)的相關(guān)性最弱。雖然有的文章顯示了lncRNA 和miRNA之間無相關(guān)性，如Yan G[17]研究表明，二者的相關(guān)系數(shù)r可信區(qū)間為-0.57～0.03，但合并后，總體上表現(xiàn)是有相關(guān)性的。通過此次分析發(fā)現(xiàn)相關(guān)性強弱不一，說明需要更多高質(zhì)量的研究去驗證這種影響對哪一類的腫瘤影響更大。目前這些研究說明了lncRNA 與miRNA 在統(tǒng)計學(xué)上存在相關(guān)性，顯示了lncRNA 和miRNA 之間存在相互作用，并且可能影響癌癥的發(fā)生發(fā)展。

此次研究存在一定的異質(zhì)性，但通過敏感性分析發(fā)現(xiàn)，總的結(jié)果穩(wěn)定性還可以接受。此次研究也存在一定的不足，第一，納入研究的人群主要在中國，因此對其他國家在這方面的影響不了解；第二，對于lncRNA 與miRNA 相互作用的研究還處于初步的探索階段，因此在不同癌癥、不同樣本量的選擇、方法學(xué)的確定等方面存在差異；第三，50%的研究樣本量比較小（＜100），而小樣本量研究被認(rèn)為與更高的異質(zhì)性有關(guān)[49]；第四，由于研究之間存在異質(zhì)性，使得納入部分可能造成對合并結(jié)果可信度的影響，因此今后還需要更多的針對癌癥的前瞻性隊列研究加以驗證。

4 結(jié)論

本次meta 分析總結(jié)了與癌癥預(yù)后有關(guān)的lncRNA 和miRNA 并分析了它們之間的相關(guān)性，說明非編碼RNA對于癌癥預(yù)后來說可能是預(yù)測因子，且lncRNA 與miRNA 之間存在相關(guān)性，可能共同發(fā)揮作用影響癌癥預(yù)后，或許可以為下一步抗腫瘤研究提供新的方向，但尚待更多高質(zhì)量的研究加以驗證。