劉旭東,馮俊,周代星,于剛
膿毒癥是機體對感染反應失調導致的危及生命的器官功能障礙疾病[1]。有研究表明,膿毒癥患者病死率高達30%~50%[2]。臨床上對于膿毒癥的治療,主要采取早期抗感染治療、液體復蘇、血管活性藥物應用及器官支持等手段[3-4]。近年來的研究表明,血管內皮細胞(VEC)功能障礙在膿毒癥進展中處于樞紐地位[5]。膿毒癥早期,內毒素作用于血管內皮細胞表面的受體,促進炎性因子大量釋放,如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)等。內毒素及炎性因子的大量釋放,直接損傷血管內皮細胞,使其通透性增加,導致毛細血管滲漏,加重組織器官灌注不足,進而導致多器官功能障礙[6-9]。因此,改善血管內皮細胞功能對降低膿毒癥的病死率至關重要,也為臨床治療膿毒癥提供了新的治療思路[10-11]。丹參酮ⅡA 是中藥丹參中最主要的生物活性成分之一,已有研究表明其通過保護內皮細胞對多種心血管疾病具有保護作用[12-13],但目前對其是否可改善膿毒癥的內皮細胞損傷還不清楚。 因此,本研究旨在觀察丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠血管內皮細胞的保護作用,并探討可能機制,報道如下。
1.1 實驗材料 (1)動物: 雄性SD大鼠36只,月齡9周,體質量 280~300 g,由湖北省實驗動物研究中心提供,飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心。本次動物實驗符合動物倫理委員會的要求,并嚴格按照《中華人民共和國實驗動物管理條例》和《實驗動物質量管理方法》的要求進行。(2)藥品與試劑:丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(諾新康,上海第一生化藥業(yè)有限公司生產);NF-κB激活—核轉運檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司生產);ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產);TUNEL檢測試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司生產)。(3) 儀器設備: 熒光顯微鏡(UFM3201型,深圳盛天儀器有限公司生產);冰箱(BL-200SM200L型,南京中大天晴儀器有限公司生產);電泳儀(EPS-300型,上海天能科技有限公司生產)。
1.2 實驗方法 實驗于2019年1—12月在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院進行。(1) 分組:健康雄性SD大鼠36只隨機數(shù)字表法分為假手術+生理鹽水(NS)組(對照組),盲腸結扎穿孔術(CLP)+NS組(膿毒癥組),CLP+丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液組(丹參酮ⅡA干預組),每組12只。(2)模型制備:大鼠術前禁食12 h,腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg),充分麻醉后置于仰臥位并固定,消毒腹部皮膚,于中下腹部做縱切口3 cm,打開腹腔,鈍性分離及游離以充分暴露盲腸,膿毒癥組和丹參酮ⅡA干預組于距盲腸末端 1 cm處采用3號縫合線環(huán)形結扎,保證腸道通暢,并據(jù)結扎處5 mm位置采用9號針頭貫穿盲腸2次,并輕擠壓確保糞便溢出,并進行后續(xù)的關閉腹腔手術;對照組僅做盲腸探查術。丹參酮ⅡA干預組術前2 h通過尾靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(20 mg/kg),對照組及膿毒癥組術前2 h通過尾靜脈注射同等量的0.9%氯化鈉注射液。(3)標本收集與保存:造模24 h后,頸椎脫臼處死大鼠,取大鼠外周血管組織,采用4%中性甲醛固定外周血管組織,24 h后采用梯度酒精脫水處理,對外周血管組織進行石蠟包埋后切成5 μm 的病理組織切片,取外周血管組織立刻放入液氮罐冷凍后-80℃冰箱保存待測。
1.3 觀測指標與方法
1.3.1 血管內皮細胞NF-κB表達檢測: 先取外周血管病理組織切片進行常規(guī)脫蠟及水化處理,然后根據(jù)NF-κB激活—核轉運檢測試劑盒的使用說明書,并參照Linghu等[4]使用的方法對組織切片進行免疫熒光染色,用熒光顯微鏡觀察染色情況。本試劑盒染色后NF-κB呈紅色熒光,細胞核呈藍色熒光。
1.3.2 血管內皮細胞凋亡及促凋亡基因 Caspase-3蛋白水平檢測:(1)細胞凋亡檢測,采用原位缺口末端標記法(TUNEL法),具體操作嚴格按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行。凋亡細胞核被染成棕黃色,未凋亡細胞核為深藍色。(2) 促凋亡基因 Caspase-3的蛋白水平檢測,采用Western-blot法,具體步驟見文獻[5]的報道,將提取好的蛋白樣品與上樣緩沖液混合,煮沸后,進行10%SDS-PAGE電泳,采用半干轉進行蛋白轉膜,根據(jù)要求加入Caspase-3的抗孵育過夜,待完成二抗孵育后進行ECL顯示處理,將數(shù)據(jù)進行Gel-Pro analyzer分析光密度, 最終結果以Caspase-3和 β-actin 的光密度比值表示。
2.1 各組大鼠血管內皮細胞NF-κB表達比較 采用免疫熒光染色后,熒光顯微鏡下NF-κB呈紅色熒光,細胞核呈藍色熒光。血管內皮細胞漿及細胞核內出現(xiàn)紅色顆粒染色即為表達NF-κB,正常血管內皮細胞(對照組)幾乎不或弱表達NF-κB。與對照組(1.32±0.56)比較,膿毒癥組(43.25±4.33)血管內皮細胞漿和細胞核均顯示不同程度的紅色顆粒染色,且血管內皮細胞中NF-κB平均光密度值均明顯高于對照組(t/P=213.158/0.000);而丹參酮ⅡA干預組(20.74±5.28)NF-κB平均光密度值明顯低于膿毒癥組(t/P=116.995/0.000),見圖1。
圖1 各組大鼠血管內皮細胞NF-κB表達比較(HE染色,×100)
2.2 各組大鼠血管內皮細胞凋亡比較 熒光顯微鏡下觀察,對照組細胞核呈圓形或橢圓形,熒光分布均勻。與對照組比較,膿毒癥組內皮細胞出現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài),胞核固縮,致密深染,染色質邊集,細胞質內可見亮藍色強熒光;與膿毒癥組比較,丹參酮ⅡA干預組細胞凋亡程度減輕,見圖2。
圖2 各組大鼠血管內皮細胞凋亡情況比較
2.3 各組大鼠血管內皮細胞Caspase-3凋亡蛋白表達比較 與對照組(0.25±0.01)比較,膿毒癥組血管內皮細胞Caspase-3表達水平(0.57±0.05)明顯增加(t/P=20.086/0.000);與膿毒癥組比較,丹參酮ⅡA干預組血管內皮細胞Caspase-3表達水平(0.30±0.25)明顯降低(t/P=24.576/0.000)。
膿毒癥是一種臨床綜合征,定義為對感染的全身反應,其特征是器官功能障礙和休克[1]。膿毒癥和隨后出現(xiàn)的多器官功能衰竭仍然是重癥監(jiān)護病房發(fā)病和死亡的主要原因。膿毒癥時,血管內皮是病原體及其毒素的關鍵宿主靶點,血液中的脂多糖(LPS)及大量炎性因子刺激血管內皮細胞,導致內皮細胞損傷[6]。膿毒癥導致的內皮細胞損傷可具體表現(xiàn)為:引起內皮細胞通透性增加,導致血管滲漏,周圍組織水腫,局部組織器官循環(huán)不足,進而導致器官功能障礙[7]。有研究表明,LPS可誘導內皮細胞程序性死亡(凋亡),抑制內皮細胞的凋亡可改善內皮細胞損傷[8]。本研究結果顯示,膿毒癥組內皮細胞出現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài),且膿毒癥組血管內皮細胞Caspase-3等凋亡蛋白表達水平增高,提示膿毒癥可誘導內皮細胞凋亡。本研究結果與多項動物實驗結果類似[9-11]。
丹參酮ⅡA是中藥丹參的脂溶性有效成分,因其特殊的藥理作用,包括舒張血管、抗凝、抗炎、清除自由基等,在我國被廣泛用于治療與循環(huán)系統(tǒng)紊亂有關的疾病[12]。動物實驗表明,丹參酮對膿毒癥大鼠小腸具有保護作用,其機制可能與抑制腸上皮細胞凋亡和減少炎性細胞因子的活化有關[13]。本研究結果顯示,丹參酮ⅡA干預組細胞凋亡程度減輕,且血管內皮細胞Caspase-3凋亡蛋白表達水平降低,提示丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠血管內皮細胞起到保護作用,其機制可能與丹參酮可抑制內皮細胞凋亡有關。
核因子-κB參與許多免疫調節(jié)介質的轉錄,這些免疫調節(jié)介質參與了膿毒癥誘導的器官衰竭發(fā)展[14]。在膿毒癥模型中,抑制NF-κB的激活可以減少急性炎性反應過程和器官功能障礙。Huang等[15]實驗研究表明,抑制NF-κB信號通路可以保護肺微血管內皮細胞免受LPS誘導的凋亡;Kurpios-Piec等[16]的研究也表明,激活NF-κB可促進炎性反應,并引起內皮細胞的損傷。由此可見,NF-κB相關因子極可能介導了炎性反應誘導的內皮細胞損害,減少NF-κB信號通路的激活對血管內皮細胞的保護至關重要。本研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥大鼠血管內皮細胞NF-κB平均光密度值明顯升高,而丹參酮ⅡA處理后NF-κB平均光密度值明顯降低。上述結果表明,膿毒癥可激活NF-κB信號通路,誘導內皮細胞凋亡,并進一步引起內皮細胞損傷;而丹參酮ⅡA干預后可抑制NF-κB信號通路的激活,起到保護內皮細胞的作用。
綜上所述,丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠血管內皮細胞具有保護作用,這可能與抑制NF-κB信號傳導通路進而抑制內皮細胞凋亡有關。
利益沖突:所有作者聲明無利益沖突
作者貢獻聲明
劉旭東:實施研究過程及論文撰寫;馮俊、周代星:實驗指導,論文修改及論文審核;于剛:提出研究思路,設計研究方案,分析實驗數(shù)據(jù)