劉旭東,馮俊,周代星,于剛

膿毒癥是機體對感染反應失調導致的危及生命的器官功能障礙疾病[1]。有研究表明，膿毒癥患者病死率高達30%～50%[2]。臨床上對于膿毒癥的治療，主要采取早期抗感染治療、液體復蘇、血管活性藥物應用及器官支持等手段[3-4]。近年來的研究表明，血管內皮細胞(VEC)功能障礙在膿毒癥進展中處于樞紐地位[5]。膿毒癥早期，內毒素作用于血管內皮細胞表面的受體，促進炎性因子大量釋放，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-2(IL-2)等。內毒素及炎性因子的大量釋放，直接損傷血管內皮細胞，使其通透性增加，導致毛細血管滲漏，加重組織器官灌注不足，進而導致多器官功能障礙[6-9]。因此，改善血管內皮細胞功能對降低膿毒癥的病死率至關重要，也為臨床治療膿毒癥提供了新的治療思路[10-11]。丹參酮ⅡA 是中藥丹參中最主要的生物活性成分之一，已有研究表明其通過保護內皮細胞對多種心血管疾病具有保護作用[12-13]，但目前對其是否可改善膿毒癥的內皮細胞損傷還不清楚。 因此，本研究旨在觀察丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠血管內皮細胞的保護作用，并探討可能機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (1)動物： 雄性SD大鼠36只，月齡9周，體質量 280～300 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心。本次動物實驗符合動物倫理委員會的要求，并嚴格按照《中華人民共和國實驗動物管理條例》和《實驗動物質量管理方法》的要求進行。(2)藥品與試劑：丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(諾新康，上海第一生化藥業(yè)有限公司生產)；NF-κB激活—核轉運檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司生產)；ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產)；TUNEL檢測試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司生產)。(3) 儀器設備： 熒光顯微鏡(UFM3201型，深圳盛天儀器有限公司生產)；冰箱(BL-200SM200L型，南京中大天晴儀器有限公司生產)；電泳儀(EPS-300型，上海天能科技有限公司生產)。

1.2 實驗方法 實驗于2019年1—12月在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院進行。(1) 分組：健康雄性SD大鼠36只隨機數(shù)字表法分為假手術+生理鹽水(NS)組(對照組)，盲腸結扎穿孔術(CLP)+NS組(膿毒癥組)，CLP+丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液組(丹參酮ⅡA干預組)，每組12只。(2)模型制備：大鼠術前禁食12 h,腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg),充分麻醉后置于仰臥位并固定,消毒腹部皮膚,于中下腹部做縱切口3 cm,打開腹腔,鈍性分離及游離以充分暴露盲腸，膿毒癥組和丹參酮ⅡA干預組于距盲腸末端 1 cm處采用3號縫合線環(huán)形結扎,保證腸道通暢,并據(jù)結扎處5 mm位置采用9號針頭貫穿盲腸2次，并輕擠壓確保糞便溢出，并進行后續(xù)的關閉腹腔手術；對照組僅做盲腸探查術。丹參酮ⅡA干預組術前2 h通過尾靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(20 mg/kg)，對照組及膿毒癥組術前2 h通過尾靜脈注射同等量的0.9%氯化鈉注射液。(3)標本收集與保存：造模24 h后，頸椎脫臼處死大鼠，取大鼠外周血管組織，采用4%中性甲醛固定外周血管組織，24 h后采用梯度酒精脫水處理，對外周血管組織進行石蠟包埋后切成5 μm 的病理組織切片，取外周血管組織立刻放入液氮罐冷凍后-80℃冰箱保存待測。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血管內皮細胞NF-κB表達檢測： 先取外周血管病理組織切片進行常規(guī)脫蠟及水化處理，然后根據(jù)NF-κB激活—核轉運檢測試劑盒的使用說明書，并參照Linghu等[4]使用的方法對組織切片進行免疫熒光染色，用熒光顯微鏡觀察染色情況。本試劑盒染色后NF-κB呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。

1.3.2 血管內皮細胞凋亡及促凋亡基因 Caspase-3蛋白水平檢測：(1)細胞凋亡檢測，采用原位缺口末端標記法(TUNEL法)，具體操作嚴格按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行。凋亡細胞核被染成棕黃色，未凋亡細胞核為深藍色。(2) 促凋亡基因 Caspase-3的蛋白水平檢測，采用Western-blot法，具體步驟見文獻[5]的報道，將提取好的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸后，進行10%SDS-PAGE電泳，采用半干轉進行蛋白轉膜，根據(jù)要求加入Caspase-3的抗孵育過夜，待完成二抗孵育后進行ECL顯示處理，將數(shù)據(jù)進行Gel-Pro analyzer分析光密度， 最終結果以Caspase-3和 β-actin 的光密度比值表示。

2 結 果

2.1 各組大鼠血管內皮細胞NF-κB表達比較 采用免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下NF-κB呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光。血管內皮細胞漿及細胞核內出現(xiàn)紅色顆粒染色即為表達NF-κB，正常血管內皮細胞(對照組)幾乎不或弱表達NF-κB。與對照組(1.32±0.56)比較，膿毒癥組(43.25±4.33)血管內皮細胞漿和細胞核均顯示不同程度的紅色顆粒染色，且血管內皮細胞中NF-κB平均光密度值均明顯高于對照組(t/P=213.158/0.000)；而丹參酮ⅡA干預組(20.74±5.28)NF-κB平均光密度值明顯低于膿毒癥組(t/P=116.995/0.000)，見圖1。

圖1 各組大鼠血管內皮細胞NF-κB表達比較(HE染色，×100)

2.2 各組大鼠血管內皮細胞凋亡比較 熒光顯微鏡下觀察，對照組細胞核呈圓形或橢圓形，熒光分布均勻。與對照組比較，膿毒癥組內皮細胞出現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài)，胞核固縮，致密深染，染色質邊集，細胞質內可見亮藍色強熒光；與膿毒癥組比較，丹參酮ⅡA干預組細胞凋亡程度減輕，見圖2。

圖2 各組大鼠血管內皮細胞凋亡情況比較

2.3 各組大鼠血管內皮細胞Caspase-3凋亡蛋白表達比較 與對照組(0.25±0.01)比較，膿毒癥組血管內皮細胞Caspase-3表達水平(0.57±0.05)明顯增加(t/P=20.086/0.000)；與膿毒癥組比較，丹參酮ⅡA干預組血管內皮細胞Caspase-3表達水平(0.30±0.25)明顯降低(t/P=24.576/0.000)。

3 討 論

膿毒癥是一種臨床綜合征，定義為對感染的全身反應，其特征是器官功能障礙和休克[1]。膿毒癥和隨后出現(xiàn)的多器官功能衰竭仍然是重癥監(jiān)護病房發(fā)病和死亡的主要原因。膿毒癥時，血管內皮是病原體及其毒素的關鍵宿主靶點，血液中的脂多糖(LPS)及大量炎性因子刺激血管內皮細胞，導致內皮細胞損傷[6]。膿毒癥導致的內皮細胞損傷可具體表現(xiàn)為：引起內皮細胞通透性增加，導致血管滲漏，周圍組織水腫，局部組織器官循環(huán)不足，進而導致器官功能障礙[7]。有研究表明，LPS可誘導內皮細胞程序性死亡(凋亡)，抑制內皮細胞的凋亡可改善內皮細胞損傷[8]。本研究結果顯示，膿毒癥組內皮細胞出現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài)，且膿毒癥組血管內皮細胞Caspase-3等凋亡蛋白表達水平增高，提示膿毒癥可誘導內皮細胞凋亡。本研究結果與多項動物實驗結果類似[9-11]。

丹參酮ⅡA是中藥丹參的脂溶性有效成分,因其特殊的藥理作用，包括舒張血管、抗凝、抗炎、清除自由基等，在我國被廣泛用于治療與循環(huán)系統(tǒng)紊亂有關的疾病[12]。動物實驗表明，丹參酮對膿毒癥大鼠小腸具有保護作用，其機制可能與抑制腸上皮細胞凋亡和減少炎性細胞因子的活化有關[13]。本研究結果顯示，丹參酮ⅡA干預組細胞凋亡程度減輕，且血管內皮細胞Caspase-3凋亡蛋白表達水平降低，提示丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠血管內皮細胞起到保護作用，其機制可能與丹參酮可抑制內皮細胞凋亡有關。

核因子-κB參與許多免疫調節(jié)介質的轉錄，這些免疫調節(jié)介質參與了膿毒癥誘導的器官衰竭發(fā)展[14]。在膿毒癥模型中，抑制NF-κB的激活可以減少急性炎性反應過程和器官功能障礙。Huang等[15]實驗研究表明，抑制NF-κB信號通路可以保護肺微血管內皮細胞免受LPS誘導的凋亡；Kurpios-Piec等[16]的研究也表明，激活NF-κB可促進炎性反應，并引起內皮細胞的損傷。由此可見，NF-κB相關因子極可能介導了炎性反應誘導的內皮細胞損害，減少NF-κB信號通路的激活對血管內皮細胞的保護至關重要。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠血管內皮細胞NF-κB平均光密度值明顯升高，而丹參酮ⅡA處理后NF-κB平均光密度值明顯降低。上述結果表明，膿毒癥可激活NF-κB信號通路，誘導內皮細胞凋亡，并進一步引起內皮細胞損傷；而丹參酮ⅡA干預后可抑制NF-κB信號通路的激活，起到保護內皮細胞的作用。

綜上所述,丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠血管內皮細胞具有保護作用，這可能與抑制NF-κB信號傳導通路進而抑制內皮細胞凋亡有關。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉旭東：實施研究過程及論文撰寫；馮俊、周代星：實驗指導，論文修改及論文審核；于剛：提出研究思路，設計研究方案，分析實驗數(shù)據(jù)