李昱江，張東麗，錢云，伏亦偉，楊斌，劉翠霞

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位于消化系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位，僅次于胃癌和食管癌[1]。但近年來(lái)，隨著人們生活和飲食習(xí)慣的改變，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率顯著上升，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)[2]。由于結(jié)直腸癌發(fā)病隱匿，患者早期臨床癥狀不明顯，大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，致使術(shù)后5年生存率低于西方發(fā)達(dá)國(guó)家。腫瘤轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素，其中肝臟是結(jié)直腸癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移靶器官之一[3]。目前對(duì)于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制仍未完全明確。星形膠質(zhì)細(xì)胞磷酸化蛋白15(PEA15)最初在星形膠質(zhì)細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，其編碼序列位于染色體1q21-22上，其基因序列在哺乳動(dòng)物基因組中具有高度保守性[4]。研究表明，PEA15在肝癌、肺癌中高表達(dá)[5-6]。MSI-2是Musashi蛋白家族的重要成員，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化的作用[7]。已有研究表明，在胃癌中存在MSI-2的異常高表達(dá)[8-9]。由于結(jié)直腸癌的發(fā)生和肝轉(zhuǎn)移與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡異常有密切關(guān)系，PEA15、MSI-2水平可能反映結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移情況和預(yù)后，但目前對(duì)于結(jié)直腸癌組織PEA15、MSI-2的表達(dá)情況及其與肝轉(zhuǎn)移、預(yù)后的關(guān)系仍缺乏相關(guān)報(bào)道。鑒于此，現(xiàn)分析PEA15、MSI-2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月—2017年12月江蘇省泰州市人民醫(yī)院/南通大學(xué)第五附屬醫(yī)院消化內(nèi)科收治結(jié)直腸癌患者180例，其中男106例，女74例，年齡42～75(61.27±7.96)歲；原發(fā)癌部位：結(jié)腸114例，直腸66例；癌灶直徑2～8(5.87±2.03)cm；組織分化程度：低分化42例，中分化57例，高分化81例；浸潤(rùn)深度：T1 39例，T2 59例，T3 51例，T4 31例；發(fā)生肝轉(zhuǎn)移38例，未發(fā)生肝轉(zhuǎn)移142例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移106例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移74例；病程7～14(10.12±2.68)年；結(jié)直腸癌誘因：高脂低纖維飲食81例，肥胖84例，其他15例；分期：Ⅰ期48例，Ⅱ期71例，Ⅲ期61例；基礎(chǔ)?。焊哐獕?5例，糖尿病29例；家族遺傳史38例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(NTDX-05YY-LS20141227)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均完成手術(shù)且獲取標(biāo)本，術(shù)后經(jīng)病理檢查確診為結(jié)直腸癌；②患者初次就診，腫瘤為首次發(fā)生，病歷資料完整；③患者本次就診前未經(jīng)過(guò)放療、化療及生物學(xué)治療。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并自身免疫疾病及結(jié)直腸外其他臟器同時(shí)發(fā)生原發(fā)性腫瘤者；②術(shù)前及術(shù)后6個(gè)月內(nèi)除肝臟外存在其他器官腫瘤轉(zhuǎn)移者；③患者身體狀況較差，預(yù)計(jì)術(shù)后生存時(shí)間<6個(gè)月者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 結(jié)直腸癌組織PEA15、MSI-2表達(dá)檢測(cè)：(1)檢測(cè)方法：術(shù)中準(zhǔn)確切取結(jié)直腸癌及距離腫瘤邊緣3 cm以上的癌旁組織標(biāo)本，經(jīng)10%甲醛固定后石蠟包埋處理，烘烤載玻片同時(shí)將蠟塊組織切成厚4 μm的連續(xù)切片。上述蠟塊組織切片經(jīng)梯度濃度乙醇溶液水化，放置在不同濃度乙醇溶液中各5 min；枸櫞酸鹽緩沖液沖洗后放入高溫高壓環(huán)境進(jìn)行抗原修復(fù)10 min；滴加3%過(guò)氧化氫(購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司)反應(yīng)5 min，枸櫞酸鹽緩沖液沖洗；向切片中滴加山羊血清(購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司)反應(yīng)5 min以封閉抗原，分別加入兔抗人PEA15單克隆抗體、MSI-2單克隆抗體(購(gòu)自英國(guó)abcam公司)，4℃下濕盒孵育過(guò)夜，加入兔來(lái)源生物學(xué)二抗反應(yīng)2 h，DAB顯色(購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司)，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇溶液脫水中性樹(shù)膠封片。以枸櫞酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照，將已知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，操作按說(shuō)明書進(jìn)行。(2)結(jié)果判定：采用半定量積分法對(duì)結(jié)果進(jìn)行賦分[10]，每張切片在400倍顯微鏡(日本OLYMPUS，型號(hào)：CKX41)下隨機(jī)觀察10個(gè)視野：①染色程度計(jì)分，無(wú)著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。②陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分，≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分。將2項(xiàng)結(jié)果乘積作為總分，≥4分為陽(yáng)性，<4分為陰性。

1.3.2 隨訪情況： 患者術(shù)后隨訪3年，隨訪日期截至2020年12月31日，并根據(jù)手術(shù)情況、術(shù)后病理及隨訪期間影像學(xué)診斷結(jié)果確定是否存在肝臟轉(zhuǎn)移。

2 結(jié) 果

2.1 不同組織PEA15、MSI-2表達(dá)比較 結(jié)直腸癌患者癌組織中PEA15、MSI-2陽(yáng)性表達(dá)率[62.22%(112/180)、71.11%(128/180)]顯著高于癌旁組織[12.22%(22/180)、14.44%(26/180)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=96.288、118.063，P均=0.000)， 見(jiàn)圖1。

2.2 結(jié)直腸癌組織中PEA15、MSI-2表達(dá)在不同臨床病理特征中比較 不同性別、年齡、原發(fā)癌部位、癌灶直徑的患者結(jié)直腸癌組織中PEA15、MSI-2陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中低分化、癌灶浸潤(rùn)深度T3～T4、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者結(jié)直腸癌組織中PEA15、MSI-2陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于高分化、癌灶浸潤(rùn)深度T1～T2、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌組織中PEA15、MSI-2表達(dá)在不同臨床病理特征中比較 [例(%)]

2.3 有無(wú)肝轉(zhuǎn)移患者結(jié)直腸癌組織中PEA15、MSI-2表達(dá)比較 肝轉(zhuǎn)移患者(38例)結(jié)直腸癌組織中PEA15、MSI-2陽(yáng)性表達(dá)率[92.11%(35/38)、97.37%(37/38)]顯著高于無(wú)肝轉(zhuǎn)移患者(142例)[54.23%(77/142)、64.08%(91/142)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2/P=18.299/0.000、16.166/0.000)。

2.4 結(jié)直腸癌組織中PEA15、MSI-2表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，結(jié)直腸癌患者癌組織中PEA15陽(yáng)性表達(dá)率與MSI-2陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.575，P=0.000)。

注： A.PEA15 在癌旁組織中表達(dá)陰性，無(wú)著色;B.PEA15在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)陽(yáng)性;C.MSI-2在癌旁組織中表達(dá)陰性，無(wú)著色；D.MSI-2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)陽(yáng)性；所示結(jié)直腸癌細(xì)胞病理性核分裂相，包漿棕黃色

2.5 結(jié)直腸癌組織中不同PEA15、MSI-2表達(dá)情況患者預(yù)后比較 隨訪患者3年，失訪12例(6.67%)，完成隨訪168例； 至隨訪結(jié)束死亡64例(38.10%)，存活104例( 61.90%)。PEA15陽(yáng)性、陰性患者生存率分別為47.22%(51/108)、88.33%(53/60)，中位生存期分別為24.55個(gè)月、34.31個(gè)月；MSI-2陽(yáng)性、陰性患者生存率分別為53.66%(66/123)、84.44%(38/45)，中位生存期分別為25.07個(gè)月、33.73個(gè)月；經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織PEA15陰性、MSI-2陰性患者生存曲線顯著優(yōu)于PEA15陽(yáng)性、MSI-2陽(yáng)性患者(χ2=26.436、22.896，P均=0.000)，見(jiàn)圖2。

注：PEA15.星形膠質(zhì)細(xì)胞磷酸化蛋白

3 討 論

目前臨床上對(duì)于結(jié)直腸癌的治療主要采用手術(shù)、放療、化療、分子靶向治療及免疫治療等[11]。隨著治療技術(shù)的不斷提升和藥物的不斷開(kāi)發(fā)，我國(guó)結(jié)直腸癌患者預(yù)后和生活質(zhì)量隨之改善，但結(jié)直腸癌患者的生存率仍低于發(fā)達(dá)國(guó)家。結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移是造成患者生存率降低的重要原因，相比其他惡性腫瘤，結(jié)直腸癌是一種侵襲性較高的惡性腫瘤，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[12-15]。有報(bào)道顯示，結(jié)直腸癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移幾率約為25%，全病程發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的比例高達(dá)40%～50%[16-18]。因此研究結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制，對(duì)于指導(dǎo)結(jié)直腸癌診斷、治療及預(yù)后判斷具有重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者癌組織中PEA15、MSI-2陽(yáng)性表達(dá)率升高。其中，PEA15是一種分子量為15 kD的磷酸化蛋白，最初在星形膠質(zhì)細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)研究證明，PEA15廣泛存在于不同組織細(xì)胞中，具有調(diào)節(jié)凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)糖代謝等功能，是一種重要的多功能蛋白[19]。Jiang等[20]報(bào)道，PEA15可通過(guò)與ERK1/2靶向結(jié)合，起到抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能。近年來(lái)有研究報(bào)道，PEA15還與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，但PEA15在腫瘤中可能具有雙重調(diào)節(jié)作用[21]。Tang等[22]報(bào)道，在肝細(xì)胞癌中PEA15可通過(guò)與ERK1/2靶向結(jié)合，起到促進(jìn)肝細(xì)胞癌增殖和侵襲的作用。Xie等[23]報(bào)道，在乳腺癌中PEA15可促進(jìn)ERK磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲。而Gawecka等[24]報(bào)道，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中PEA15可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果與Tang等[22]報(bào)道相符，結(jié)合文獻(xiàn)分析PEA15可能通過(guò)與ERK1/2靶向結(jié)合，起到抗結(jié)直腸細(xì)胞凋亡、促進(jìn)直腸細(xì)胞增殖的作用，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生。MSI-2是由328個(gè)氨基酸組成的蛋白，其氨基酸末端序列有2個(gè)高度保守的RNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域，這2個(gè)結(jié)構(gòu)域又分別包含2個(gè)核糖核蛋白，MSI-2的RNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域可以直接識(shí)別靶RNA，并與之結(jié)合，從而起到調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的作用[25]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，MSI-2與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系[26]。Choi等[27]報(bào)道，MSI-2可通過(guò)下調(diào)Bax，上調(diào)Bcl-2，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。Sugai等[28]報(bào)道，沉默MSI-2后，細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)水平降低，P21表達(dá)水平升高，細(xì)胞凋亡比例增加，并認(rèn)為MSI-2可通過(guò)促進(jìn)周期蛋白D1表達(dá)，抑制P21表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果提示，在結(jié)直腸癌發(fā)病過(guò)程中，MSI-2可能通過(guò)下調(diào)Bax，上調(diào)Bcl-2，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；促進(jìn)周期蛋白D1表達(dá)，抑制P21表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖等引發(fā)結(jié)直腸細(xì)胞癌變。

本研究還發(fā)現(xiàn)，PEA15、MSI-2與結(jié)直腸癌分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，結(jié)直腸癌患者癌組織中PEA15陽(yáng)性表達(dá)率與MSI-2陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)，提示兩者可能在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起到協(xié)同作用，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

肝臟是結(jié)直腸癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移靶器官之一，但目前對(duì)于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍未完全明確。本研究結(jié)果提示，PEA15、MSI-2在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮了重要作用，分析PEA15、MSI-2可能通過(guò)調(diào)控ERK1/2、Bax、Bcl-2、周期蛋白D1、P21等促進(jìn)結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌患者PEA15、MSI-2表達(dá)情況也與患者預(yù)后密切相關(guān)，提示臨床上可通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌組織PEA15、MSI-2表達(dá)情況為結(jié)直腸癌患者預(yù)后判斷提供依據(jù)。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中存在PEA15、MSI-2異常高表達(dá)，兩者表達(dá)情況與結(jié)直腸癌分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)。除此之外，PEA15、MSI-2表達(dá)水平與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，PEA15、MSI-2陽(yáng)性表達(dá)患者總體預(yù)后較PEA15、MSI-2陰性患者差，提示PEA15、MSI-2可能在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的診斷和預(yù)后判斷中具有一定價(jià)值。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

李昱江：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫；張東麗、錢云：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；伏亦偉、楊斌：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；劉翠霞：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核