羅華榮，王天如，陳晨，黃盛松，卞崔冬，孫祖俊，吳登龍

膀胱癌屬泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)惡性腫瘤，手術(shù)切除是目前首選治療方法，但部分腫瘤會(huì)發(fā)生浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移，且經(jīng)過(guò)化療后易造成化療耐藥性，因此，影響治療效果[1]?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)可損壞細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，且已驗(yàn)證在膀胱癌中發(fā)揮作用[2]。類(lèi)固醇受體共激活因子(steroid receptor coactivator，SRC)/黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)信號(hào)通路激活后會(huì)形成一個(gè)雙重的激酶復(fù)合物，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞生長(zhǎng)，在癌細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和遷移過(guò)程[3]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)ROS可作用于SRC/FAK信號(hào)通路從而影響相關(guān)腫瘤疾病進(jìn)展，影響病情[4]。因此，現(xiàn)分析癌組織的臨床病理因素，并以膀胱癌T24細(xì)胞為研究對(duì)象，驗(yàn)證誘發(fā)膀胱癌疾病進(jìn)展的原因，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 癌組織及細(xì)胞：收集2019年6月—2020年12月同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科經(jīng)膀胱鏡活檢、膀胱部分切除的膀胱癌組織標(biāo)本69份，同時(shí)取癌旁組織作為對(duì)照。腫瘤病理分級(jí)(histopathological grading，簡(jiǎn)稱G)根據(jù)世界衛(wèi)生組織分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[5]，臨床分期(tumor node metastasis staging，TNM，簡(jiǎn)稱T)根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟分期標(biāo)準(zhǔn)[6]，為便于分析，將G1和G2歸為分化較好，G3和G4歸為分化較差；T0和T1歸為非浸潤(rùn)性，T2、T3、T4歸為浸潤(rùn)性；其中分化較好59份，分化較差10份；浸潤(rùn)性34份，非浸潤(rùn)性35份。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(審批號(hào)：2019-TYH-051)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

膀胱癌T24細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，批號(hào) SCSP-536。

1.1.2 試劑與儀器：ROS清除劑N,N'-二甲基硫脲(DMTU，美國(guó)Biochem公司生產(chǎn))；SRC激酶抑制劑(PP2，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn))；RPMI1640培養(yǎng)液、BCA試劑盒、DAB顯色試劑、ROS檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))；兔抗人SRC一抗、磷酸化SRC(phosphorylation-SRC，p-SRC)一抗、FAK一抗、磷酸化FAK(phosphorylation-FAK，p-FAK)一抗、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)一抗、鈣蛋白酶2(calcium-activated neutral protease 2，calpain2)一抗、GAPDH一抗、兔抗人二抗(英國(guó)Abcam公司生產(chǎn))。顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司，型號(hào) XDS-800C)；CO2培養(yǎng)箱(杭州聚同電子有限公司，型號(hào) CHP-01)；蛋白凝膠成像儀(上海Tanton公司，型號(hào) 5200)。

1.2 膀胱癌T24細(xì)胞處理及分組 膀胱癌T24細(xì)胞在含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液(添加青霉素、鏈霉素各1 000 IU/L，完全培養(yǎng)液)中培養(yǎng)，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱，待細(xì)胞密度達(dá)90%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為對(duì)照組、DMTU干預(yù)組、DMTU+PP2干預(yù)組。1×105個(gè)/孔細(xì)胞置于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，各組細(xì)胞更換無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。對(duì)照組更換為完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；DMTU干預(yù)組用完全培養(yǎng)液稀釋DMTU濃度20 μmol/L處理30 min，再更換為完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；DMTU+PP2干預(yù)組用完全培養(yǎng)液稀釋DMTU濃度20 μmol/L和PP2濃度5 μmol/L共同處理30 min，再更換為完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 免疫組化檢測(cè)膀胱癌組織、癌旁組織中SRC、FAK陽(yáng)性表達(dá)：病理組織常規(guī)切片后，孵育SRC、FAK一抗，正常兔血清代替一抗作為陰性對(duì)照。由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師對(duì)病理組織免疫標(biāo)記結(jié)果分析和計(jì)數(shù)。染色結(jié)果為棕黃色或棕褐色，則判定為陽(yáng)性；細(xì)胞無(wú)色或淡黃色，則判定為陰性。

1.3.2 細(xì)胞ROS水平檢測(cè)：收集各組膀胱癌T24細(xì)胞，按照ROS檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組細(xì)胞ROS相對(duì)含量。

1.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膀胱癌T24細(xì)胞遷移、侵襲情況： 收集各組膀胱癌T24細(xì)胞，無(wú)胎牛血清培養(yǎng)液稀釋成1×104個(gè)/ml，取500 μl置于Transwell小室上層，下室加500 μl完全培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，去除培養(yǎng)液，甲醇固定后結(jié)晶紫染色，拍照后計(jì)數(shù)每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)量以檢測(cè)細(xì)胞遷移情況，每個(gè)小室5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)并取平均值為遷移細(xì)胞數(shù)量。Transwell小室經(jīng)基質(zhì)膠包被，其余步驟與遷移步驟相同以檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況。

1.3.4 蛋白免疫印跡(WB)檢測(cè)細(xì)胞中SRC、p-SRC、FAK、p-FAK、MMP-9、calpain2蛋白表達(dá)： 收集各組膀胱癌T24細(xì)胞，蛋白裂解液裂解細(xì)胞，4℃離心收集上清，BCA試劑盒測(cè)定蛋白總濃度。每孔上樣30 ng，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，聚偏氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；對(duì)應(yīng)加入一抗SRC、p-SRC、FAK、p-FAK、MMP-9、calpain2、GAPDH(均為1∶2 000)，4℃孵育過(guò)夜；對(duì)應(yīng)加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。DAB顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 癌旁組織、膀胱癌組織中SRC、FAK陽(yáng)性表達(dá)比較 SRC陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞膜上，F(xiàn)AK陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞漿中，見(jiàn)圖1。與癌旁組織比較，膀胱癌組織中SRC、FAK陽(yáng)性比例升高(P<0.01)，見(jiàn)表1。69例膀胱癌患者癌組織中，SRC陽(yáng)性表達(dá)39例(56.52%)，F(xiàn)AK陽(yáng)性表達(dá)44例(63.77%)。

表1 膀胱癌患者癌組織及癌旁組織SRC、FAK陽(yáng)性表達(dá)比較 [例(%)]

2.2 膀胱癌組織SRC、FAK表達(dá)陽(yáng)性率在不同臨床病理特征中比較 膀胱癌組織中SRC、FAK表達(dá)陽(yáng)性率在不同分化程度中比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在浸潤(rùn)性膀胱癌組織中陽(yáng)性率高于非浸潤(rùn)性癌組織(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 膀胱癌組織SRC、FAK表達(dá)陽(yáng)性率在不同臨床病理特征中比較 [例(%)]

2.3 3組膀胱癌T24細(xì)胞ROS相對(duì)含量比較 與對(duì)照組(0.45±0.08)比較，DMTU干預(yù)組(0.26±0.04)含量下降；與DMTU干預(yù)組比較，DMTU+PP2干預(yù)組(0.64±0.03)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=73.011，P=0.000)。

2.4 3組膀胱癌T24細(xì)胞遷移、侵襲比較 與對(duì)照組比較，DMTU干預(yù)組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量升高(P<0.05)；與DMTU干預(yù)組比較，DMTU+PP2干預(yù)組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表3。

注：SRC.類(lèi)固醇受體共激活因子；FAK.黏著斑激酶

注：DMTU.N,N'-二甲基硫脲；PP2.SRC激酶抑制劑

表3 3組膀胱癌T24細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量比較個(gè)/HP)

2.5 3組膀胱癌T24細(xì)胞中SRC、p-SRC、FAK、p-FAK、MMP-9、calpain2蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，DMTU干預(yù)組細(xì)胞中p-SRC/SRC、p-FAK/FAK、MMP-9、calpain2蛋白水平升高(P<0.05)；與DMTU干預(yù)組比較，DMTU+PP2干預(yù)組細(xì)胞中SRC、p-SRC/SRC、p-FAK/FAK、MMP-9、calpain2蛋白水平降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表4。

表4 3組膀胱癌T24細(xì)胞中SRC、p-SRC、FAK、p-FAK、MMP-9、calpain2蛋白水平比較

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)膀胱癌發(fā)病率為8.05/10萬(wàn)，病死率達(dá)3.29/10萬(wàn)，難根治、易復(fù)發(fā)、易耐藥、易轉(zhuǎn)移等，導(dǎo)致膀胱癌5年生存率在50%左右[7]。盡管膀胱癌采取多種方法進(jìn)行治療，但患者由于自身并發(fā)癥等原因?qū)е虏荒褪?，影響治療[8]。發(fā)現(xiàn)與膀胱癌有關(guān)基因?qū)τ诩霸鐚?duì)應(yīng)治療具有至關(guān)重要作用。

注：DMTU.N,N'-二甲基硫脲；PP2.SRC激酶抑制劑；SRC.類(lèi)固醇受體共激活因子；p-SRC.磷酸化SRC；FAK.黏著斑激酶；p-FAK.磷酸化FAK；MMP-9.基質(zhì)金屬蛋白酶9；calpain2.鈣蛋白酶2；GAPDH.內(nèi)參基因

本研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌細(xì)胞中ROS降低，ROS及其所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激一直以來(lái)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展及耐藥的主要原因，適度ROS可促進(jìn)腫瘤增殖，過(guò)度ROS可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死[9]。ROS穩(wěn)定對(duì)于維持機(jī)體正常生理活動(dòng)具有重要作用，正常情況下，機(jī)體氧化—抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡，ROS作為信號(hào)因子參與細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化等細(xì)胞存活途徑[10]。在膀胱癌中ROS生成破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原體系平衡，可引起DNA損傷、促進(jìn)關(guān)鍵蛋白氧化[11-12]。ROS調(diào)控黏附分子的表達(dá)和血管形成等過(guò)程，影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[13-14]。降低膀胱癌細(xì)胞中ROS水平可能促進(jìn)黏附分子的表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲，進(jìn)而加重疾病。

本研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌中,SRC、FAK蛋白陽(yáng)性率升高，且SRC、FAK蛋白陽(yáng)性表達(dá)與癌組織浸潤(rùn)性關(guān)系密切。SRC在腫瘤細(xì)胞中異?；罨?，可迅速激活下游信號(hào)通路因子磷酸化，通過(guò)復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)影響細(xì)胞黏附，進(jìn)而影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[15]。SRC可通過(guò)肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的拆卸、絲足體的組裝和黏著斑的共同作用調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)[16]；其是腫瘤獲得遷移潛能的核心分子，可促進(jìn)多種蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的遷移、侵襲[17]。FAK是內(nèi)源性蛋白酪氨酸激酶激活的主要底物，與腫瘤細(xì)胞黏附、增殖、遷移、侵襲等過(guò)程密切相關(guān)[18]。SRC通過(guò)其SH2結(jié)構(gòu)域與FAK的Tyr397自動(dòng)磷酸化位點(diǎn)直接結(jié)合形成FAK-SRC復(fù)合物，進(jìn)而向胞內(nèi)傳遞信號(hào)，促使細(xì)胞增殖、遷移、侵襲[19]。SRC、FAK蛋白水平升高可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移過(guò)程，促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)，促使疾病發(fā)生。清除ROS后細(xì)胞SRC、FAK磷酸化水平升高，促進(jìn)侵襲、遷移相關(guān)蛋白MMP-9、calpain2蛋白表達(dá)，而FAK可以直接刺激MMP-9的分泌，參與膀胱間質(zhì)成分的代謝，參與血管新生、影響細(xì)胞黏附作用從而影響腫瘤遷移、侵襲[20]。calpain2與FAK蛋白進(jìn)行剪切進(jìn)而影響FAK活性，從而改變細(xì)胞局部的黏附能力，可能是調(diào)控細(xì)胞遷移的機(jī)制之一[21-22]。提示降低ROS水平可促進(jìn)SRC的表達(dá)及其磷酸化水平，從而與FAK結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)MMP-9等基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲、遷移，腫瘤浸潤(rùn)從而影響疾病。抑制SRC表達(dá)可抑制上述過(guò)程。

綜上所述，在膀胱癌細(xì)胞中抑制ROS可促進(jìn)SRC/FAK信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲過(guò)程，使腫瘤浸潤(rùn)誘導(dǎo)疾病。SRC/FAK信號(hào)通路亦影響細(xì)胞凋亡等過(guò)程進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)展，是以后研究的重點(diǎn)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

羅華榮：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；王天如、陳晨：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；黃盛松、卞崔冬：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；孫祖?。哼M(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；吳登龍：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫(xiě)