黃祥，魏丹丹，王云，鮑捷

在世界范圍內(nèi)肺癌發(fā)病率、病死率均較高，是癌癥死亡的主要原因之一，包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌2個主要類型，其中非小細胞肺癌約占肺癌總數(shù)的85%[1]。肺癌患者預(yù)后狀況主要依賴于臨床的早期診斷和早期治療，其中手術(shù)切除是治療肺癌的有效手段，然而其5年術(shù)后生存率仍不高[2]。尋找與肺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的生物標志物，對改善預(yù)后有重要意義。微小RNA-454-3p(microRNA-454-3p，miR-454-3p)在多種類型的癌癥中均異常表達，可發(fā)揮致癌或抑癌基因的作用，且研究表明，miR-454-3p在肺癌中高表達[3-5]。胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白1(cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1，CPEB1)在結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤細胞中表達水平均下降[6-7]。通過生物信息學預(yù)測網(wǎng)站miRDB(http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-454-3p與CPEB1存在靶向結(jié)合位點。推測miR-454-3p可能靶向調(diào)控CPEB1進而參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測非小細胞肺癌組織中miR-454-3p、CPEB1 信使RNA(mRNA)表達，探討二者與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為非小細胞肺癌患者治療提供新靶點，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年4月—2016年3月在中國科學院合肥腫瘤醫(yī)院經(jīng)胸部影像學及組織病理學等確診為非小細胞肺癌患者96例，術(shù)中取其癌組織設(shè)為肺癌組，癌旁正常組織為對照組。其中男59例，女37例，年齡44～76(56.48±10.24)歲，≤55歲43例，>55歲53例；有吸煙史40例，無吸煙史56例；腫瘤直徑≤3 cm 50例，>3 cm 46例；病理類型：腺癌41例，鱗癌55例；有淋巴結(jié)遠處轉(zhuǎn)移者42例，無淋巴結(jié)遠處轉(zhuǎn)移者54例；分化程度：中/高分化55例，低分化41例；TNM分期[8]：Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ～Ⅳ期39例。本研究經(jīng)中國科學院合肥腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(批號LS-20140317)。患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①患者均符合“中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版)”中關(guān)于非小細胞肺癌的診斷標準[9]；②均為初治患者，患者術(shù)前未接受過化療、放療等輔助治療；③病歷資料及影像學檢查信息完整者。(2)排除標準：①有嚴重肝腎功能異常及其他急慢性感染性疾病者；②有其他肺部疾病者；③妊娠期及哺乳期婦女；④伴有其他部位惡性腫瘤或有惡性腫瘤史者。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平測定： 采用RNA提取試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司)及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)提取肺癌組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用qRT-PCR儀(型號7300，美國ABI公司)對miR-454-3p、CPEB1 mRNA及其內(nèi)參(miR-454-3p以U6作為內(nèi)參，CPEB1 mRNA以GAPDH作為內(nèi)參)進行擴增，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA(50 ng/μl)1 μl，qPCR SYBR?Green Master Mix(熒光定量PCR試劑，武漢純度生物科技有限公司) 5 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，ddH2O 3.2 μl。每份樣品設(shè)3個重復孔，采用2-△△CT法計算組織miR-454-3p、CPEB1 mRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2 隨訪： 采用電話或門診等方式對患者隨訪5年，術(shù)后第1年每月1次，術(shù)后第2年每3個月1次，2年后每6個月1次?；颊呱嫫趶氖中g(shù)之日起計算，隨訪時間截止到2021年3月31日，統(tǒng)計5年內(nèi)患者的生存情況。

2 結(jié) 果

2.1 2組miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平比較 肺癌組miR-454-3p表達水平高于對照組，CPEB1 mRNA表達水平低于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 2組miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平比較

2.2 癌組織中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平在不同臨床病理特征中比較 以患者癌組織中miR-454-3p(均值1.56)、CPEB1 mRNA(均值0.67)表達水平為界，將患者分為miR-454-3p低表達亞組47例，miR-454-3p高表達亞組49例，CPEB1 mRNA低表達亞組50例，CPEB1 mRNA高表達亞組46例。結(jié)果顯示，患者癌組織miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平在不同性別、年齡、吸煙史、分化程度中比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而在不同腫瘤直徑、病理類型、淋巴結(jié)遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期中比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 肺癌患者癌組織中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平在不同臨床病理特征中比較 [例(%)]

2.3 癌組織中miR-454-3p與CPEB1 mRNA表達水平的相關(guān)性 非小細胞肺癌患者癌組織中miR-454-3p與CPEB1 mRNA表達呈負相關(guān)(r=-0.524，P=0.000)。

2.4 患者癌組織中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平與預(yù)后的關(guān)系 采用Kaplan-Meier法分析癌組織中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平與患者生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示96例患者5年存活46例，死亡50例。miR-454-3p高表達患者5年生存率34.69%(17/49)低于miR-454-3p低表達患者61.70%(29/47)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.012，P=0.008)；CPEB1 mRNA高表達患者5年生存率58.70%(27/46)高于CPEB1 mRNA低表達患者38.00%(19/50)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.112，P=0.043)。

2.5 影響非小細胞肺癌患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析 以肺癌患者是否死亡為因變量，以miR-454-3p、CPEB1 mRNA、腫瘤直徑、病理類型、淋巴結(jié)遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，miR-454-3p高表達、淋巴結(jié)遠處轉(zhuǎn)移是影響非小細胞肺癌患者死亡的獨立危險因素(P<0.05)，CPEB1 mRNA高表達是影響患者死亡的保護因素(P<0.01)，見表4。

表4 影響非小細胞肺癌患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

肺癌是一種源于支氣管黏膜的高度惡性腫瘤，其具體的分子機制尚不明確，盡管近年來其治療方法更加個體化和多樣化，但其預(yù)后和療效仍不十分理想，嚴重威脅患者的生命健康[10-12]。近年來，分子靶向治療在肺癌患者中已取得了較大進步，可有效改善預(yù)后，且療效有持續(xù)作用，為晚期肺癌患者帶來新希望[13-14]。但仍有部分患者未從中獲益，因此，需探索更多新的分子靶向生物標志物來滿足臨床需求。

許多miRNA可通過調(diào)控靶基因表達，參與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[15-18]。miR-454-3p是近年來發(fā)現(xiàn)的參與多種腫瘤生物過程的miRNA[19-20]。CPEB1是一類特殊序列的mRNA結(jié)合蛋白，它在配子形成、細胞衰老、癌癥病因等方面發(fā)揮重要作用，控制健康與疾病的轉(zhuǎn)化。CPEB1可通過調(diào)控mRNA poly(A)的長度影響翻譯過程[21-22]。Hui等[23]研究結(jié)果顯示，miR-454-3p通過過表達下調(diào)CPEB1進而抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果中，miR-454-3p在非小細胞肺癌組織中的表達水平高于對應(yīng)的癌旁正常組織，CPEB1 mRNA表達水平低于癌旁正常組織，且在肺癌組織中二者表達水平呈負相關(guān)，miR-454-3p表達趨勢與Jin等[5]在肝細胞癌中研究結(jié)果相符，但miR-454-3p、CPEB1表達與Hui等[23]報道二者在膠質(zhì)母細胞瘤中的表達趨勢不相符，分析其表達差異可能是由于miR-454-3p、CPEB1在膠質(zhì)母細胞瘤和肺癌中調(diào)控的通路及發(fā)揮的作用不一致，提示miR-454-3p可能通過高表達下調(diào)CPEB1進而促進肺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究中患者癌組織miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平與腫瘤直徑、病理類型、淋巴結(jié)遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)。提示miR-454-3p、CPEB1可能與肺癌細胞的增殖、遷移及侵襲等行為密切相關(guān)，推測高表達的miR-454-3p靶向下調(diào)CPEB1表達水平，CPEB1調(diào)控特殊時期mRNA poly(A)的長度，進而調(diào)控mRNA多聚腺苷化的作用減弱，最終影響翻譯過程和細胞周期，增加惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生；亦或CPEB1表達下調(diào)后使細胞黏附力降低，可能導致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增加癌細胞遷移和侵襲能力。此外，本研究發(fā)現(xiàn)miR-454-3p高表達、CPEB1 mRNA低表達的患者5年生存率較低，miR-454-3p高表達是影響非小細胞肺癌患者死亡的獨立危險因素，CPEB1 mRNA高表達是影響患者死亡的保護因素。提示臨床醫(yī)師可通過密切監(jiān)測miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達水平是否異常，及時調(diào)整治療方案，阻止不良預(yù)后發(fā)生。

綜上所述，非小細胞肺癌組織中miR-454-3p呈高表達，CPEB1 mRNA呈低表達，與非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有密切聯(lián)系，對非小細胞肺癌調(diào)控機制的進一步研究有重要作用。此外，本研究可能為提高非小細胞肺癌患者診療效果提供新思路，對今后尋找新的治療靶點起到積極的推動作用。然而本研究存在不足之處，miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達可能與腫瘤位置、患者個體狀態(tài)等各方面因素有關(guān)，有待今后納入更多樣本和影響因素進行多中心的前瞻性研究來進一步驗證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

黃祥：設(shè)計研究方案，課題設(shè)計，實施研究過程，論文撰寫；魏丹丹：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；王云：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；鮑捷：進行統(tǒng)計學分析