黃祥，魏丹丹，王云，鮑捷

在世界范圍內(nèi)肺癌發(fā)病率、病死率均較高，是癌癥死亡的主要原因之一，包括非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌2個(gè)主要類型，其中非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的85%[1]。肺癌患者預(yù)后狀況主要依賴于臨床的早期診斷和早期治療，其中手術(shù)切除是治療肺癌的有效手段，然而其5年術(shù)后生存率仍不高[2]。尋找與肺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物，對(duì)改善預(yù)后有重要意義。微小RNA-454-3p(microRNA-454-3p，miR-454-3p)在多種類型的癌癥中均異常表達(dá)，可發(fā)揮致癌或抑癌基因的作用，且研究表明，miR-454-3p在肺癌中高表達(dá)[3-5]。胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白1(cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1，CPEB1)在結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平均下降[6-7]。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站miRDB(http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-454-3p與CPEB1存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。推測(cè)miR-454-3p可能靶向調(diào)控CPEB1進(jìn)而參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌組織中miR-454-3p、CPEB1 信使RNA(mRNA)表達(dá)，探討二者與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為非小細(xì)胞肺癌患者治療提供新靶點(diǎn)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年4月—2016年3月在中國(guó)科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院經(jīng)胸部影像學(xué)及組織病理學(xué)等確診為非小細(xì)胞肺癌患者96例，術(shù)中取其癌組織設(shè)為肺癌組，癌旁正常組織為對(duì)照組。其中男59例，女37例，年齡44～76(56.48±10.24)歲，≤55歲43例，>55歲53例；有吸煙史40例，無(wú)吸煙史56例；腫瘤直徑≤3 cm 50例，>3 cm 46例；病理類型：腺癌41例，鱗癌55例；有淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者42例，無(wú)淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者54例；分化程度：中/高分化55例，低分化41例；TNM分期[8]：Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ～Ⅳ期39例。本研究經(jīng)中國(guó)科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)LS-20140317)。患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均符合“中國(guó)原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版)”中關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；②均為初治患者，患者術(shù)前未接受過(guò)化療、放療等輔助治療；③病歷資料及影像學(xué)檢查信息完整者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重肝腎功能異常及其他急慢性感染性疾病者；②有其他肺部疾病者；③妊娠期及哺乳期婦女；④伴有其他部位惡性腫瘤或有惡性腫瘤史者。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達(dá)水平測(cè)定： 采用RNA提取試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司)及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司)提取肺癌組織總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用qRT-PCR儀(型號(hào)7300，美國(guó)ABI公司)對(duì)miR-454-3p、CPEB1 mRNA及其內(nèi)參(miR-454-3p以U6作為內(nèi)參，CPEB1 mRNA以GAPDH作為內(nèi)參)進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA(50 ng/μl)1 μl，qPCR SYBR?Green Master Mix(熒光定量PCR試劑，武漢純度生物科技有限公司) 5 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，ddH2O 3.2 μl。每份樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，采用2-△△CT法計(jì)算組織miR-454-3p、CPEB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2 隨訪： 采用電話或門診等方式對(duì)患者隨訪5年，術(shù)后第1年每月1次，術(shù)后第2年每3個(gè)月1次，2年后每6個(gè)月1次?；颊呱嫫趶氖中g(shù)之日起計(jì)算，隨訪時(shí)間截止到2021年3月31日，統(tǒng)計(jì)5年內(nèi)患者的生存情況。

2 結(jié) 果

2.1 2組miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達(dá)水平比較 肺癌組miR-454-3p表達(dá)水平高于對(duì)照組，CPEB1 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 2組miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 癌組織中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達(dá)水平在不同臨床病理特征中比較 以患者癌組織中miR-454-3p(均值1.56)、CPEB1 mRNA(均值0.67)表達(dá)水平為界，將患者分為miR-454-3p低表達(dá)亞組47例，miR-454-3p高表達(dá)亞組49例，CPEB1 mRNA低表達(dá)亞組50例，CPEB1 mRNA高表達(dá)亞組46例。結(jié)果顯示，患者癌組織miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達(dá)水平在不同性別、年齡、吸煙史、分化程度中比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在不同腫瘤直徑、病理類型、淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 肺癌患者癌組織中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達(dá)水平在不同臨床病理特征中比較 [例(%)]

2.3 癌組織中miR-454-3p與CPEB1 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性 非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中miR-454-3p與CPEB1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.524，P=0.000)。

2.4 患者癌組織中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系 采用Kaplan-Meier法分析癌組織中miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達(dá)水平與患者生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示96例患者5年存活46例，死亡50例。miR-454-3p高表達(dá)患者5年生存率34.69%(17/49)低于miR-454-3p低表達(dá)患者61.70%(29/47)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.012，P=0.008)；CPEB1 mRNA高表達(dá)患者5年生存率58.70%(27/46)高于CPEB1 mRNA低表達(dá)患者38.00%(19/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.112，P=0.043)。

2.5 影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析 以肺癌患者是否死亡為因變量，以miR-454-3p、CPEB1 mRNA、腫瘤直徑、病理類型、淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，miR-454-3p高表達(dá)、淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響非小細(xì)胞肺癌患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，CPEB1 mRNA高表達(dá)是影響患者死亡的保護(hù)因素(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4 影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

肺癌是一種源于支氣管黏膜的高度惡性腫瘤，其具體的分子機(jī)制尚不明確，盡管近年來(lái)其治療方法更加個(gè)體化和多樣化，但其預(yù)后和療效仍不十分理想，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[10-12]。近年來(lái)，分子靶向治療在肺癌患者中已取得了較大進(jìn)步，可有效改善預(yù)后，且療效有持續(xù)作用，為晚期肺癌患者帶來(lái)新希望[13-14]。但仍有部分患者未從中獲益，因此，需探索更多新的分子靶向生物標(biāo)志物來(lái)滿足臨床需求。

許多miRNA可通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[15-18]。miR-454-3p是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的參與多種腫瘤生物過(guò)程的miRNA[19-20]。CPEB1是一類特殊序列的mRNA結(jié)合蛋白，它在配子形成、細(xì)胞衰老、癌癥病因等方面發(fā)揮重要作用，控制健康與疾病的轉(zhuǎn)化。CPEB1可通過(guò)調(diào)控mRNA poly(A)的長(zhǎng)度影響翻譯過(guò)程[21-22]。Hui等[23]研究結(jié)果顯示，miR-454-3p通過(guò)過(guò)表達(dá)下調(diào)CPEB1進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果中，miR-454-3p在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平高于對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織，CPEB1 mRNA表達(dá)水平低于癌旁正常組織，且在肺癌組織中二者表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，miR-454-3p表達(dá)趨勢(shì)與Jin等[5]在肝細(xì)胞癌中研究結(jié)果相符，但miR-454-3p、CPEB1表達(dá)與Hui等[23]報(bào)道二者在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)趨勢(shì)不相符，分析其表達(dá)差異可能是由于miR-454-3p、CPEB1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肺癌中調(diào)控的通路及發(fā)揮的作用不一致，提示miR-454-3p可能通過(guò)高表達(dá)下調(diào)CPEB1進(jìn)而促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究中患者癌組織miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達(dá)水平與腫瘤直徑、病理類型、淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)。提示miR-454-3p、CPEB1可能與肺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲等行為密切相關(guān)，推測(cè)高表達(dá)的miR-454-3p靶向下調(diào)CPEB1表達(dá)水平，CPEB1調(diào)控特殊時(shí)期mRNA poly(A)的長(zhǎng)度，進(jìn)而調(diào)控mRNA多聚腺苷化的作用減弱，最終影響翻譯過(guò)程和細(xì)胞周期，增加惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)生；亦或CPEB1表達(dá)下調(diào)后使細(xì)胞黏附力降低，可能導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增加癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。此外，本研究發(fā)現(xiàn)miR-454-3p高表達(dá)、CPEB1 mRNA低表達(dá)的患者5年生存率較低，miR-454-3p高表達(dá)是影響非小細(xì)胞肺癌患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，CPEB1 mRNA高表達(dá)是影響患者死亡的保護(hù)因素。提示臨床醫(yī)師可通過(guò)密切監(jiān)測(cè)miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達(dá)水平是否異常，及時(shí)調(diào)整治療方案，阻止不良預(yù)后發(fā)生。

綜上所述，非小細(xì)胞肺癌組織中miR-454-3p呈高表達(dá)，CPEB1 mRNA呈低表達(dá)，與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有密切聯(lián)系，對(duì)非小細(xì)胞肺癌調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步研究有重要作用。此外，本研究可能為提高非小細(xì)胞肺癌患者診療效果提供新思路，對(duì)今后尋找新的治療靶點(diǎn)起到積極的推動(dòng)作用。然而本研究存在不足之處，miR-454-3p、CPEB1 mRNA表達(dá)可能與腫瘤位置、患者個(gè)體狀態(tài)等各方面因素有關(guān)，有待今后納入更多樣本和影響因素進(jìn)行多中心的前瞻性研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

黃祥：設(shè)計(jì)研究方案，課題設(shè)計(jì)，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫；魏丹丹：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；王云：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；鮑捷：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析