唐智奇，楊帆，盧東東，楊梅，苗林，方迪海

心肌炎屬于臨床常見心血管疾病，主要由細(xì)菌、病毒、真菌感染或藥物、毒素、全身性疾病、自身免疫失調(diào)引發(fā)。病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由多種嗜心肌病毒引發(fā)的心肌非特異性炎性反應(yīng)[1-2]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示， VMC發(fā)病率占心肌炎絕大部分，腸道病毒、柯薩奇病毒感染引起的VMC占50%以上。近年來，受社會(huì)發(fā)展、環(huán)境變化等因素影響，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，以無明顯癥狀的心肌局灶性炎性反應(yīng)為唯一的臨床表現(xiàn)，若未及時(shí)接受有效治療，則會(huì)出現(xiàn)心律失常、心源性休克甚至猝死等表現(xiàn)，對患者生命健康造成嚴(yán)重威脅[3-4]。目前，VMC發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，且目前臨床上仍缺乏有效治療手段及藥物[5]。為尋求安全有效的治療方法，現(xiàn)建立VMC小鼠模型，通過PI3K/AKT通路分析沉默腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子6(TRAF6)對VMC模型小鼠的干預(yù)效果，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1) 動(dòng)物：選取健康雄性SD小鼠44只，由南京君科生物工程有限公司提供。月齡6～9(7.5±1.3)月，體質(zhì)量187～219(203.0±13.6)g。飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度(23.1±1.6)℃，相對濕度45%～55%，12 h晝夜交替照明飼養(yǎng)1周。給予標(biāo)準(zhǔn)鼠科動(dòng)物飼料，不限制飲水、飲食。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。(2)試藥試劑：柯薩奇病毒(CBV)已在Hela細(xì)胞上傳代并反復(fù)凍融3次后測定半數(shù)組織感染劑量為10-3/L；柯薩奇病毒3(CVB3)、總DNA提取試劑盒(伯信生物公司)，ago TRAF、antagoTRAF(上海恒斐生物科技有限公司)；(3)儀器設(shè)備：顯微鏡(上海永科光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)， YKJ-660型)；超聲心動(dòng)圖儀(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司，BK flex Focus 1202 )；熒光定量PCR儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，Applied BiOSystems]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 VMC動(dòng)物模型建立：2019年9月—2020年9月于廣西柳州市工人醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)數(shù)字表法抽取SD健康小鼠11只不做處理作為正常組。其余小鼠33只建立VMC模型，測定CVB3滴度后，按照劑量經(jīng)腹腔注射病毒稀釋液0.2 ml， 1次/d，連續(xù)注射3 d。建模過程中死亡5只，成功28只，將建模成功小鼠隨機(jī)分為模型組9只，上調(diào)組9只，沉默組10只。上調(diào)組小鼠尾部靜脈注射agoTRAF 630 mg/kg，沉默組小鼠尾部靜脈注射antagoTRAF 630 mg/kg，正常組、模型組小鼠尾部靜脈注射等劑量0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行干預(yù)。

1.2.2 標(biāo)本采集及HE染色：所有小鼠干預(yù)1周后取靜脈血3 ml，離心獲取上層血清，置于-70℃環(huán)境下保存。最后一次干預(yù)后24 h后斷頭處死小鼠，分離心臟取心肌組織行常規(guī)石蠟包埋及3 μm連續(xù)切片。切片烤干后行脫蠟處理，后順序置于不同濃度酒精中復(fù)水3 min；蘇木精染色15 min后清洗3次，鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗后以1%伊紅染色，使用酒精脫水處理后脫蠟包埋，封片后于顯微鏡下觀察。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 小鼠心功能檢查：小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，胸部備皮，呈左側(cè)臥位，以超聲心動(dòng)圖采用標(biāo)準(zhǔn)胸骨旁左心室長軸及短軸二維切面，監(jiān)測左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)，并計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.3.2 小鼠血清CK-MB、cTnT、IL-6、TNF-α、IFN-γ、SOD、MDA水平檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測。將血清置于室溫后，標(biāo)記酶標(biāo)板，制作標(biāo)準(zhǔn)品，然后取出試劑盒，以1∶2稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔上依次加入稀釋好的待測血清和標(biāo)準(zhǔn)品100 μl/孔，放置37 ℃恒溫孵育箱中濕育2 h；然后用專用洗滌液將反應(yīng)板清洗3次后，再加入抗體工作液(1∶100稀釋)100 μl/孔，放于37 ℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板4次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白(cTnT)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)溶液100 μl /孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100 μl /孔終止反應(yīng)，于酶標(biāo)測試儀(美國Bio-Tek公司)450 nm處讀數(shù)，計(jì)算CK-MB、cTnT、IL-6、TNF-α、IFN-γ、SOD、MDA水平。

1.3.3 小鼠心肌PI3K、AKT蛋白表達(dá)：采用Western-blot法檢測。取出小鼠待檢心肌組織，用蛋白裂解液及裂解細(xì)胞低溫離心后取上清，BCA進(jìn)行蛋白定量檢測，在2×SDS凝膠緩沖液中加入蛋白50 μg，在100℃環(huán)境中蛋白變性5 min。凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜/取膜，置于5%脫脂牛奶中固定、封閉處理1 h，將一抗使用0.05%～0.1% TBST稀釋(PPAR-γ、NFAT-4一抗為1∶1 000)，4 ℃過夜孵育保存，后使用0.05%～0.1% TBST重復(fù)洗膜3次，5 min/次，二抗0.05%～0.1% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動(dòng)孵育 1 h，再次采用TBST連續(xù)洗膜3次，處理5 min。DAB顯色，定量分析蛋白表達(dá)情況。

1.3.4 小鼠心肌TRAF6 mRNA基因表達(dá)檢測：使用RT-PCR檢測TRAF6 mRNA表達(dá)。取出待檢心肌組織，提取心肌組織中 TRAF6細(xì)胞總RNA，對其純度、含量進(jìn)行檢測，隨后逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列如下，上游引物：5＇-GCCGAAATGGAAGCACAG-3＇；下游引物：5＇-GGGCTATGGATGACAACAGG-3＇，內(nèi)參U6。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25℃ 10 min,40 ℃ 60 min,85 ℃ 5 min；擴(kuò)增條件:94 ℃ 20 s、72℃ 30 s、60℃ 30 s,35個(gè)循環(huán)，采用2-△△Ct方法計(jì)算TRAF6 mRNA表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠心肌組織病理比較 正常組心肌纖維排列整齊，細(xì)胞間隙清晰；模型組心肌纖維排列紊亂，部分間質(zhì)纖維化伴斷裂，局灶性炎性細(xì)胞浸潤；上調(diào)組心肌細(xì)胞排列紊亂、稀疏，間質(zhì)纖維化，部分出現(xiàn)斷裂，局灶性炎性細(xì)胞浸潤；沉默組心肌纖維排列整齊，部分?jǐn)嗔?，?xì)胞間隙正常，見圖1。

圖1 各組小鼠心肌組織病理變化(HE染色，×400)

2.2 各組小鼠心功能比較 與正常組比較，模型組LVESD、LVEDD升高，LVEF降低(P<0.05)；與模型組比較，上調(diào)組LVESD、LVEDD升高，LVEF降低(P<0.05)，沉默組LVESD、LVEDD降低，LVEF升高； 與上調(diào)組比較， 沉默組LVESD、LVEDD降低，LVEF升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠心功能指標(biāo)比較

2.3 各組小鼠心肌損傷標(biāo)志物水平比較 與正常組比較，模型組小鼠CK-MB、cTnT水平升高(P<0.05)；與模型組比較，上調(diào)組CK-MB、cTnT水平升高(P<0.05)，沉默組CK-MB、cTnT水平降低；與上調(diào)組比較，沉默組CK-MB、cTnT水平降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠心肌損傷標(biāo)志物水平比較

2.4 各組小鼠血清炎性因子水平比較 與正常組比較，模型組IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高(P<0.05)；與模型組比較，上調(diào)組IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高(P<0.05)，沉默組IL-6、TNF-α、IFN-γ水平降低；與上調(diào)組比較，沉默組CK-MB、cTnT水平降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠血清炎性因子水平比較

2.5 各組小鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 與正常組比較，模型組SOD水平降低，MDA水平升高(P<0.05)；與模型組比較，上調(diào)組SOD水平降低，MDA水平升高(P<0.05)，沉默組SOD水平升高，MDA水平降低；與上調(diào)組比較，沉默組SOD水平升高，MDA水平降低(P<0.05)，見表4。

表4 各組小鼠血清氧化應(yīng)激水平比較

2.6 各組小鼠心肌PI3K、AKT蛋白和TRAF6 mRNA表達(dá)比較 與正常組比較，模型組PI3K、AKT蛋白、TRAF6 mRNA表達(dá)升高 (P<0.05)；與模型組比較，上調(diào)組PI3K、AKT蛋白、TRAF6 mRNA表達(dá)升高，沉默組PI3K、AKT蛋白、TRAF6 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與上調(diào)組比較，沉默組PI3K、AKT蛋白、TRAF6 mRNA表達(dá)降低 (P<0.05)，見表5、圖2。

表5 各組小鼠PI3K、AKT蛋白和TRAF6 mRNA表達(dá)比較

圖2 各組小鼠PI3K、AKT蛋白表達(dá)比較

3 討 論

VMC作為臨床常見心血管疾病，病理改變以病毒感染所致心肌細(xì)胞變性壞死、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤等為主，進(jìn)而引發(fā)不同程度心功能障礙及全身癥狀[6]。據(jù)流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，在病毒流行感染期間，約有5%患者患有心肌炎，以不同程度的發(fā)熱、咳嗽、全身酸痛等癥狀為主要臨床表現(xiàn)，也有少數(shù)患者出現(xiàn)心力衰竭、心源性休克、猝死等，對患者生命安全造成嚴(yán)重威脅[7-8]。相關(guān)資料顯示，多種病毒均會(huì)導(dǎo)致心肌炎的發(fā)生，常見病毒包括腸道病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒及柯薩奇病毒等。臨床證實(shí)柯薩奇病毒感染是導(dǎo)致VMC患者突發(fā)心臟病并致死的主要原因[9-10]。

相關(guān)研究顯示，CVB3作為最重要的病原體，在進(jìn)入機(jī)體后其快速復(fù)制導(dǎo)致病毒血癥發(fā)生，進(jìn)而對心肌間質(zhì)造成損傷，導(dǎo)致炎性因子大量釋放，促進(jìn)病情發(fā)展。目前，VMC發(fā)病機(jī)制尚不清楚，相關(guān)研究顯示，病毒侵入刺激的免疫反應(yīng)在VMC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[11-12]。通過對小鼠VMC模型研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞表面具有特異性CVB3受體，接種CVB3病毒后心肌炎發(fā)生可達(dá)100%；另有研究顯示，在小鼠注射CVB3病毒后，其心肌組織發(fā)生明顯炎性浸潤反應(yīng)[13-14]。

當(dāng)心肌損傷發(fā)生后胞漿中游離的心肌損傷標(biāo)志物呈現(xiàn)異常表達(dá)。CK-MB、cTnT是臨床常見心肌損傷標(biāo)志物。相關(guān)研究顯示，在心肌損傷后CK-MB、cTnT迅速升高至原水平的5～10倍，具有極高的敏感度，在臨床VMC診斷中對其水平檢測具有重要意義[15-16]。

相關(guān)研究顯示，心肌炎病變的發(fā)生發(fā)展與炎性因子水平具有密切聯(lián)系，炎性細(xì)胞浸潤及心肌損傷是VMC主要病理特點(diǎn)[17-19]。臨床常見炎性因子包括IL-6、TNF-α、IFN-γ，在VMC感染初期IL-6水平呈快速上升，產(chǎn)生防御作用。同時(shí)，在VMC感染初期TNF-α可被病毒識別作為抗原激活巨噬細(xì)胞，高表達(dá)TNF-α通過作用相關(guān)蛋白導(dǎo)致心肌損傷[20-21]。相關(guān)資料顯示，正常心肌組織代謝會(huì)產(chǎn)生SOD活性氧，在心肌組織受到病毒攻擊時(shí)大量氧自由基生成，進(jìn)而消耗SOD清除自由基，使機(jī)體內(nèi)SOD水平降低。同時(shí)細(xì)胞中氧化自由基數(shù)量升高，與不飽和脂肪酸結(jié)合生產(chǎn)MDA。由此認(rèn)定通過對SOD、MDA水平檢測能夠有效反映細(xì)胞損傷程度[22]。

相關(guān)研究顯示，TRAF6表達(dá)具有一定變化規(guī)律，且TRAF6 mRNA和蛋白表達(dá)與心肌病變病理呈顯著正相關(guān)。另有研究顯示，在健康小鼠心肌組織中TRF6 mRNA蛋白表達(dá)量較少，可能通過ERK、PI3K、P38MAPK等信號通路，與生存、分化、增殖及凋亡等多種生物學(xué)過程具有密切聯(lián)系。由此證明在VMC發(fā)生發(fā)展中TRAF6參與其中，并在CVB3致VMC發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[23-24]。

綜上所述，通過PI3K/AKT通路沉默TRAF6對柯薩奇VMC模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，可有效降低炎性反應(yīng)，減輕心肌損傷程度及提高心功能,為臨床治療柯薩奇VMC提供參考依據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

唐智奇、楊帆、盧東東：設(shè)計(jì)研究方案、實(shí)施研究過程，論文撰寫；楊梅、苗林：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；方迪海：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析