李彥忠，喻軍強(qiáng)，李明

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心，蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)甘肅省西部草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，蘭州大學(xué)草業(yè)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020）

紫花苜蓿（Medicago sativa，簡(jiǎn)稱為苜蓿）是全世界重要的豆科類牧草，在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著極其重要的作用［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，苜蓿在全世界的種植面積約3220萬hm2，和小麥（Triticum aestivum）在美國并列成為第三大重要作物；我國紫花苜蓿種植面積約377萬hm2，居各類栽培牧草之首，主要分布于西北、華北和東北地區(qū)［2－5］。因其蛋白質(zhì)含量高、氨基酸含量豐富、產(chǎn)量高、適口性好，故有“牧草之王”的美譽(yù)［6］。苜蓿栽培草地的種植規(guī)模和生產(chǎn)水平是衡量一個(gè)國家畜牧業(yè)現(xiàn)代化程度的重要標(biāo)志［7］。但是目前我國苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在諸多問題，最主要的問題是產(chǎn)不足需、質(zhì)量水平不高［8－9］。隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，其對(duì)苜蓿的需求量越來越多，而現(xiàn)階段無論在數(shù)量上還是在質(zhì)量上，我國生產(chǎn)的苜蓿均無法滿足畜牧業(yè)生產(chǎn)的需要［10－11］。2016年我國進(jìn)口苜蓿近150萬t，進(jìn)口量約為2008年的80倍。據(jù)估計(jì)近年我國苜蓿約50%的需求總量仍需依賴進(jìn)口［11］。

苜蓿病害會(huì)降低草產(chǎn)品的質(zhì)量和生產(chǎn)性能，并且會(huì)危害家畜健康，我國在紫花苜蓿上已發(fā)現(xiàn)36種真菌病害［12］。苜蓿褐斑?。≒seudopeziza medicaginis）是一種常見的苜蓿病害，隨著病害程度的加深，病葉與健葉相比，光合速率和粗蛋白含量均顯著下降，葉片中總酚、單寧、鈣、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗灰分均顯著增加［13－14］。由夏季霜霉菌（Peronospora aestivalis）引致的苜蓿霜霉病是一種世界性病害，嚴(yán)重影響世界各國的苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展［15］。在我國，已知該病分布于14個(gè)省，不同海拔地區(qū)均有分布，均可造成危害［15］。其可使苜蓿的草產(chǎn)量、品質(zhì)、種子產(chǎn)量和根瘤大幅度下降［16］；能明顯影響苜蓿的生理和生物學(xué)性狀，感染植株與健康植株相比，株高、分枝數(shù)、花序數(shù)、水分含量和葉綠素含量均出現(xiàn)不同程度的下降［17］；能使苜蓿葉片光合作用降低，有機(jī)物貯量和根系養(yǎng)分積累減少，植株越冬不良，草地提早衰敗退化，已成為我國苜蓿生產(chǎn)的主要限制性病害之一［18］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年由根腐病造成的苜蓿產(chǎn)量損失在20%左右，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)40%［19－20］。苜蓿根腐病普遍發(fā)生在我國西北（甘肅、新疆、青海等）、華北（河北和內(nèi)蒙古等）和東北地區(qū)（黑龍江和吉林等）等苜蓿主要種植區(qū)，其能降低植株根系吸收水分的能力，影響幼苗的正常生長，從而導(dǎo)致植株生物量下降，甚至使植株死亡［21－23］。

防治苜蓿病害的措施有很多，抗病品種的利用是防治苜蓿及其他牧草病害的最有效和最主要的措施之一［15，24－27］。因此，本研究于2015年對(duì)在蘭州大學(xué)榆中校區(qū)試驗(yàn)地種植的48個(gè)苜蓿品種進(jìn)行了田間病害調(diào)查，調(diào)查發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)地內(nèi)的主要病害是褐斑病、霜霉病和根腐病。安歡樂［28］經(jīng)分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)鑒定、分子鑒定、致病性測(cè)定和再分離，最終確定根腐病的主要病原為銳頂鐮刀菌（Fusarium acuminatum）。并對(duì)48個(gè)品種進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，以期篩選出優(yōu)良、優(yōu)質(zhì)和抗病性強(qiáng)的苜蓿品種，為選擇適合當(dāng)?shù)胤N植的苜蓿品種和抗病育種材料的選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于蘭州大學(xué)榆中校區(qū)，屬溫帶大陸性氣候，海拔1680 m（35.87° N，104.09° E），年均降水量為381.8 mm，蒸發(fā)量為1450 mm，無霜期120 d左右，相對(duì)濕度63%，全年日照時(shí)數(shù)2607.2 h，年平均氣溫為6.7℃，1月平均氣溫－8℃，7月平均氣溫19.0℃，試驗(yàn)地平坦，在苜蓿生長期灌溉2～3次，采用大水漫灌。于2013年6月進(jìn)行播種。

1.2 供試苜蓿品種

總計(jì)48個(gè)供試苜蓿品種（表1）。

表1 供試苜蓿品種及其來源Table 1 Alfalfa varieties and their resources in the experiment

1.3 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)品種3個(gè)重復(fù)，小區(qū)面積5.0 m×2.4 m，小區(qū)間距0.6 m，穴播，每個(gè)小區(qū)共計(jì)24株苜蓿，株距和行距均為0.6 m，在苜蓿生長期灌水3次，未施肥。

1.4 病害調(diào)查與抗病性評(píng)價(jià)

1.4.1 病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 各地上病害的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)田間發(fā)病情況并參照北美苜蓿會(huì)議（North American Alfalfa Improvement Conference，NAAIC）的標(biāo)準(zhǔn)略有改動(dòng)后制定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［29］，共分為5個(gè)病級(jí)，其中0級(jí)，植株莖葉無病斑，葉片呈正常的綠色；1級(jí)，病斑占葉片面積的25%以下；2級(jí)，病斑占葉片面積的26%～50%，并且葉片開始褪綠；3級(jí)，病斑占葉片面積的51%～75%，病斑壞死且葉片發(fā)黃；4級(jí)，病斑占葉片面積的75%以上，葉片發(fā)黃并脫落。

1.4.2 病害調(diào)查 于2015年5－7月對(duì)病害進(jìn)行了調(diào)查，用一般調(diào)查和重點(diǎn)調(diào)查相結(jié)合的方法。一般調(diào)查主要了解苜蓿病害的分布以及發(fā)病程度，進(jìn)行分析歸類。一般調(diào)查后將發(fā)生嚴(yán)重的病害進(jìn)行重點(diǎn)調(diào)查，深入了解其分布、發(fā)病率、發(fā)生規(guī)律等［30］。統(tǒng)計(jì)每小區(qū)內(nèi)（全部植株）發(fā)病植株數(shù)和各病級(jí)植株數(shù)，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。

1.4.3 抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 參照美國苜蓿和牧草聯(lián)盟（National Alfalfa & Forage Alliance，NAFA，2019）的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)健康植株的百分比確定每個(gè)品種的抗病級(jí)別（表2）。

表2 抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Evaluation criteria of resistance ratings

1.5 測(cè)定指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)每小區(qū)內(nèi)所有植株的株高（地面至最高處垂直距離）和分枝數(shù)。

1.6 綜合評(píng)價(jià)

采用隸屬值函數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)賦予權(quán)重法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，具體步驟如下［31］：采用公式（1）計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值。

式中：μ（Xj）代表第j個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xj表示第j個(gè)指標(biāo)值；Xmin表示第j個(gè)指標(biāo)的最小值；Xmax則表示第j個(gè)指標(biāo)的最大值。如果指標(biāo)與抗病性呈正相關(guān)時(shí)用公式（1）計(jì)算該指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，若指標(biāo)與抗病性呈負(fù)相關(guān)時(shí)用公式（2）進(jìn)行反隸屬函數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，計(jì)算該指標(biāo)的隸屬函數(shù)值。

采用公式（3）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)（Vj），歸一化后得到各個(gè)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)（Wj），見公式（4）。

采用公式（5）計(jì)算各品種的綜合評(píng)價(jià)值。

式中：D為用若干指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)所得的綜合評(píng)價(jià)值。根據(jù)D值的大小對(duì)供試材料抗病性的強(qiáng)弱進(jìn)行排序，D值越大抗病性越強(qiáng)，反之則越弱。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010、SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 48個(gè)苜蓿品種累計(jì)死亡率比較

48個(gè)品種的累計(jì)死亡率介于0～93.07%，累計(jì)死亡率最高的是UC-1465，為93.07%；累計(jì)死亡率介于26%～74%的品種有8個(gè)，分別是Avrora、甘農(nóng)5號(hào)、Hunter Field、Hunter River、Saranac AR、Siriver、Trifecta、UC-1887；累計(jì)死亡率介于1%～3%的品種有11個(gè)，分別是Derby、Vertus、甘農(nóng)4號(hào)、寧苜1號(hào)、蔚縣、圖牧1號(hào)、圖牧2號(hào)、草原2號(hào)、Sanditi、中蘭1號(hào)、中苜1號(hào)；其余28個(gè)品種的死亡率均為0；品種間差異顯著（P＜0.05）（表3）。

表3 48個(gè)苜蓿品種的累計(jì)死亡率Table 3 Cumulative mortality rate of 48 alfalfa varieties

2.2 48個(gè)苜蓿品種株高和分枝數(shù)比較

不同品種間的同一指標(biāo)各有差異。從株高來看，48份苜蓿材料的株高在0～67.50 cm（表4），株高最高的品種是中蘭1號(hào)；株高為0 cm的品種有15個(gè)，分別是Avrora、Orca、Saranac、Saranac AR、UC-1887、UC-1465、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、WL343HQ、甘農(nóng)1號(hào)、甘農(nóng)3號(hào)、甘農(nóng)6號(hào)、中牧1號(hào)；株高介于50～64 cm的品種有9個(gè)，分別是新牧1號(hào)、Vertus、隴東苜蓿、天水、新疆大葉、中苜1號(hào)、中苜3號(hào)、公農(nóng)2號(hào)、蔚縣；株高介于1～16 cm的品種有3個(gè)，分別是Trifecta、Arc、Sanditi；其余20個(gè)品種的株高介于17～49 cm；品種間差異顯著（P＜0.05）。

表4 48個(gè)苜蓿品種株高和分枝數(shù)比較Table 4 Comparison of plant height and branch number of 48 alfalfa varieties

從分枝數(shù)來看，48份苜蓿材料的分枝數(shù)在0～56枝（表4），分枝數(shù)最多的品種是Vertus，為56枝；分枝數(shù)為0的 品 種 有15個(gè)，分 別 是Avrora、Orca、Saranac、Saranac AR、UC-1887、UC-1465、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、WL343HQ、甘農(nóng)1號(hào)、甘農(nóng)3號(hào)、甘農(nóng)6號(hào)、中牧1號(hào)；分枝數(shù)介于30～56枝的品種有11個(gè)，分別是Vertus、中苜1號(hào)、公農(nóng)1號(hào)、公農(nóng)2號(hào)、中蘭1號(hào)、蔚縣、中苜3號(hào)、新疆大葉、隴東苜蓿、天水和新牧1號(hào)；分枝數(shù)介于1～10枝的品種有7個(gè)，分別是Arc、Sanditi、Trifecta、Vernal、甘農(nóng)4號(hào)、Jindera和甘農(nóng)7號(hào)；其余15個(gè)品種的分枝數(shù)介于11～29枝；品種間差異顯著（P＜0.05）。

2.3 不同苜蓿品種間抗褐斑病的比較

48個(gè)苜蓿品種褐斑病的發(fā)病率在33.33%～100.00%（表5），且不同品種褐斑病的發(fā)病率存在顯著差異（P＜0.05）。其中發(fā)病率最低的是UC-1465，發(fā)病率僅為33.33%；發(fā)病率達(dá)到100%的有20個(gè)品種，分別是Vertus、WL168HQ、WL354HQ、WL343HQ、公農(nóng)2號(hào)、甘農(nóng)1號(hào)、甘農(nóng)3號(hào)、甘農(nóng)5號(hào)、甘農(nóng)6號(hào)、甘農(nóng)7號(hào)、中蘭1號(hào)、寧苜1號(hào)、新疆大葉、Jindera、天水、蔚縣、中苜3號(hào)、無棣、隴中、圖牧1號(hào)；其余27個(gè)品種的發(fā)病率介于34%～99%。

48個(gè)苜蓿品種褐斑病的病情指數(shù)范圍為17.78～52.22（表5），其中UC-1887、Vernal的病情指數(shù)均最低，僅為17.78，并與甘農(nóng)1號(hào)、新牧2號(hào)存在顯著差異（P＜0.05）；病情指數(shù)高于52的材料有2份，分別為甘農(nóng)1號(hào)、新牧2號(hào)，其余44個(gè)品種的病情指數(shù)介于18～52。

參照NAFA標(biāo)準(zhǔn)，48個(gè)苜蓿品種對(duì)褐斑病的抗性是UC-1465為高抗（HR）品種，UC-1887為抗?。≧）品種，Siriver和Trifecta為中抗（MR）品種，Avrora、Hunter River、Saranac AR為低抗（LR）品種，其余41個(gè)品種均為感病（S）品種（表5）。

表5 48個(gè)苜蓿品種的褐斑病發(fā)病情況及其抗病級(jí)別Table 5 Incidence of common leaf spot and resistance level of 48 alfalfa varieties

2.4 不同苜蓿品種間抗霜霉病的比較

48個(gè)苜蓿品種霜霉病的發(fā)病率在0～27.77%（表6），其中Avrora、Orca、Saranac、Saranac AR、UC-1887、UC-1465、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、甘農(nóng)1號(hào)、甘農(nóng)3號(hào)、甘農(nóng)6號(hào)、中牧1號(hào)的發(fā)病率為0；新疆大葉和天水的發(fā)病率均最高，為27.77%；其余32個(gè)品種的發(fā)病率介于1.37%～25.63%。

48個(gè)苜蓿品種霜霉病的病情指數(shù)范圍為0～81.67（表6），其中Avrora、Hunter Field、Orca、Saranac、Saranac AR、UC-1887、UC-1465、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、WL343HQ、甘農(nóng)1號(hào)、甘農(nóng)3號(hào)、甘農(nóng)5號(hào)、甘農(nóng)6號(hào)、中牧1號(hào)的病情指數(shù)為0，并與品種蔚縣、中苜1號(hào)等存在顯著差異（P＜0.05）；病情指數(shù)高于78的材料有4份，分別為新疆大葉、蔚縣、中苜1號(hào)、新牧1號(hào)；其余27個(gè)品種的病情指數(shù)介于1～78。

參照NAFA標(biāo)準(zhǔn)，48個(gè)苜蓿品種均高抗苜蓿霜霉病（表6）。

表6 48個(gè)苜蓿品種的霜霉病發(fā)病情況及其抗性級(jí)別Table 6 Incidence of downy mildew and resistance level of 48 alfalfa varieties

續(xù)表Continued Table

2.5 不同苜蓿品種間抗銳頂鐮刀菌根腐病的比較

48個(gè)苜蓿品種銳頂鐮刀菌的發(fā)病率在0～33.33%（表7），其中發(fā)病率最低的是Saranac、Siriver、WL168HQ、WL354HQ、WL319HQ、WL363HQ、甘農(nóng)3號(hào)、中蘭1號(hào)、Jindera、天水、中苜3號(hào)、無棣、隴中、甘農(nóng)2號(hào)，發(fā)病率為0；發(fā)病率最高的是UC-1465，為33.33%；其余33個(gè)品種的發(fā)病率均介于1.40%～27.77%。

參照NAFA標(biāo)準(zhǔn)，48個(gè)苜蓿品種均高抗苜蓿銳頂鐮刀菌根腐?。ū?）。

表7 48個(gè)苜蓿品種銳頂鐮刀菌根腐病發(fā)病情況及其抗性級(jí)別Table 7 The incidence and resistance level of F.acuminatum root rot in 48 alfalfa varieties

2.6 紫花苜蓿種質(zhì)資源綜合評(píng)價(jià)

采用隸屬值函數(shù)結(jié)合各個(gè)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，對(duì)48個(gè)苜蓿品種進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)［31］。D值越大，表明該品種抗病性越強(qiáng)，反之越弱。根據(jù)D值的大小進(jìn)行排序，排在前面3個(gè)的苜蓿品種為Vertus、中蘭1號(hào)和新牧1號(hào)；評(píng)分最低的3個(gè)品種為UC-1887、UC-1465和Saranac AR（表8）。

表8 48個(gè)苜蓿品種的綜合評(píng)價(jià)得分及其排序Table 8 Comprehensive evaluation scores and ranking of 48 alfalfa varieties

續(xù)表Continued Table

3 討論

研究表明，銳頂鐮刀菌可以侵染植物的根莖部和根部，同時(shí)也可作為初侵染和次侵染而引起植物根腐病的發(fā)生［32－34］。本研究發(fā)現(xiàn)在蘭州大學(xué)榆中校區(qū)品種比較試驗(yàn)田中，苜蓿矮小、萎蔫、死亡植株較多，且在死亡苜蓿植株上分離到了銳頂鐮刀菌等病原真菌，安歡樂［28］經(jīng)過致病性測(cè)定和再分離發(fā)現(xiàn)，銳頂鐮刀菌致病性最強(qiáng)，再分離率也較高，可導(dǎo)致植株根部和根莖部出現(xiàn)明顯的變色，這是本研究中死亡植株較多的主要原因。

李春杰等［15］、金娟等［35］、陳申寬等［36］、辛寶寶等［37］分別對(duì)苜蓿品種在不同地區(qū)主要病害進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)和鑒定，本試驗(yàn)得到的結(jié)果與這些學(xué)者有所不同，可能是由于評(píng)價(jià)方法不同引起的，本試驗(yàn)是以健康植株比例為主要指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)的，而李春杰等［15］、陳申寬等［36］、辛寶寶等［37］是以發(fā)病率和病情指數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)的，金娟等［35］是以相對(duì)抗性指數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)的。因此應(yīng)該建立統(tǒng)一的抗病評(píng)價(jià)體系和指標(biāo)，這樣能夠更有效地篩選適合我國不同地區(qū)種植的苜蓿抗病品種，以便加速中國苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

在進(jìn)行不同苜蓿品種抗真菌病害的評(píng)價(jià)時(shí)，參考指標(biāo)主要有發(fā)病率、病情指數(shù)、形態(tài)學(xué)指標(biāo)和生理學(xué)指標(biāo)等，所有的這些指標(biāo)都從不同的層面反映出植物對(duì)于病害的響應(yīng)，即使忽略各指標(biāo)間的差異，僅采用單一指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，不能充分體現(xiàn)苜蓿材料的綜合表現(xiàn)［38］。因此需要構(gòu)建綜合評(píng)價(jià)模型，將以上指標(biāo)進(jìn)行整合，通過科學(xué)的計(jì)算和分析，客觀地將所有品種按照抗病性進(jìn)行分類，以便應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中［39］。目前，應(yīng)用綜合評(píng)價(jià)模型對(duì)品種的綜合性能進(jìn)行評(píng)價(jià)的研究較少，本試驗(yàn)應(yīng)用的隸屬函數(shù)分析法，克服了用單一指標(biāo)來評(píng)價(jià)苜?？共⌒源嬖谄嫘院筒环€(wěn)定性的弊端，評(píng)價(jià)結(jié)果更可靠。

4 結(jié)論

本研究在甘肅省榆中縣對(duì)48個(gè)苜蓿品種進(jìn)行了抗褐斑病、霜霉病及銳頂鐮刀菌根腐病的評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：供試的48個(gè)苜蓿品種均高抗霜霉病和銳頂鐮刀菌根腐病，對(duì)褐斑病的抗性品種為高抗品種1個(gè)（UC-1465），抗病品種1個(gè)（UC-1887），中抗品種2個(gè)，低抗品種3個(gè)，其余41個(gè)品種均為感病品種。

對(duì)48個(gè)苜蓿品種進(jìn)行隸屬函數(shù)分析，結(jié)果表明：Vertus、中蘭1號(hào)和新牧1號(hào)對(duì)褐斑病、霜霉病和銳頂鐮刀菌根腐病均具有較強(qiáng)的抗病性，為高抗品種；UC-1887、UC-1465和Saranac AR對(duì)褐斑病、霜霉病和銳頂鐮刀菌根腐病的抗病性均較差，為感病品種。若以上3種病害在該地區(qū)造成重大損失時(shí)，應(yīng)首選上述高抗品種在該地區(qū)進(jìn)行栽培種植。