李世征，賈軼東，袁 媛

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110033；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 116600)

下肢缺血性疾病是由下肢動脈狹窄或閉塞所致的嚴重的肢體血液循環(huán)障礙，可引起潰瘍、壞疽、跛行等癥狀，致殘率、病死率高[1-2]。缺血區(qū)血管新生不足是缺血性疾病的主要病理改變，因此促進血管新生、恢復(fù)血供是實現(xiàn)損傷修復(fù)的關(guān)鍵[3-4]。西醫(yī)促血管新生技術(shù)，雖可有效重建缺血部位的側(cè)支循環(huán)，但存在諸多不確定因素，短期內(nèi)難以在臨床中廣泛應(yīng)用，探討有效、簡便可行的防治方法是臨床研究的重要課題。中醫(yī)藥以多靶點、多效應(yīng)、整體調(diào)節(jié)為特點，在缺血性疾病的防治中具有獨特優(yōu)勢。中醫(yī)認為，下肢動脈硬化閉塞是元氣虧虛，氣血相失，血運不暢所致，氣滯、血瘀、痰凝、壅滯經(jīng)絡(luò)是主要的病理表現(xiàn)，氣虛為發(fā)病之根本，因此應(yīng)重視補氣[5-7]。人參大補元氣，主補五臟，固脫生津，通血脈，主治病癥符合動脈硬化的病因病機及相關(guān)表現(xiàn)[8-9]。黑參是九蒸九曬炮制的人參，是一種人參的新炮制品[10]。本研究旨在探討黑參煎劑對小鼠下肢缺血模型血管新生的影響及可能的作用機制，為黑參煎劑在下肢缺血性疾病臨床防治中的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 購入雄性載脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)基因敲除小鼠84只和雄性C57野生小鼠42只后，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級動物室內(nèi)[許可證號：SYXK(遼)2013-0009]。本項目嚴格遵循動物福利倫理相關(guān)法規(guī)和各項規(guī)定開展研究。

1.2 試劑與儀器 黑參煎劑由遼寧省中醫(yī)藥研究院自制。水合氯醛(江西德成制藥有限公司，國藥準字H36022087)。 CD34、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)一抗及相應(yīng)二抗均購自北京百奧萊博科技有限公司。激光多普勒血流儀(吉安德爾科技有限公司)；輪轉(zhuǎn)式切片機(德國leica公司)；E-Gel Imager凝膠成像儀、Fisher Biotech電泳儀均為美國Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠下肢缺血模型的建立：4周齡雄性ApoE基因敲除小鼠84只和4周齡雄性C57野生小鼠42只，購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。觀察小鼠狀態(tài)良好后，ApoE基因敲除小鼠和C57野生小鼠，分別以高脂飲食和正常飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境為恒溫21～22 °C，濕度55%～65%，同時保持安靜通風(fēng)，所有小鼠自由食水，12 h晝夜節(jié)律。喂養(yǎng)4周后，采用改良縮窄股動脈法復(fù)制小鼠右下肢動脈慢性缺血模型，具體方法如下：在室溫(22℃)條件下，給予小鼠10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上，用酒精消毒皮膚，并剪開2～2.5 cm的縱形切口。在大腿表面可看到一條紅色血管，循向上血管隱沒，在隱沒處剪開1個小口，向下沿著血管剪開1 cm，根據(jù)血管走形再向上剪開1.5 cm。分離顯露游離股動脈，4-0絲線結(jié)扎時連同7號細注射器系牢后抽出注射器針頭，縫合切口。C57野生小鼠只切開并分離動靜脈后縫合，不結(jié)扎縮窄，作為假手術(shù)組。ApoE基因敲除小鼠右下肢動脈縮窄術(shù)后進行激光多普勒血流測定，散光強度降低而不消失則造模成功。評價模型成功后，將ApoE基因敲除小鼠編號，隨機分為模型對照組和黑參煎劑組，每組42只。正品人參炮制后制成黑參，煎煮后濃縮，黑參煎劑組取0.5 ml/次，每日灌胃1次，模型對照組和假手術(shù)組取0.9%氯化鈉溶液，0.5 ml/次，每日灌胃1次，連續(xù)灌胃14 d。

1.3.2 下肢缺血癥狀觀察與評價：利用體式顯微鏡觀察小鼠后肢外觀(脫毛、趾甲增厚、壞死)評分。評分標準[11]：0分表示無壞死；1分表示1個腳趾壞死；2分表示2個或多個腳趾壞死；3分表示出現(xiàn)足壞死；4分表示下肢有壞死；5分表示是整個大腿自行離斷。注意并記錄周邊紅腫情況。

1.3.3 激光多普勒檢測小鼠缺血下肢血流灌：術(shù)前及術(shù)后即刻、7、14、21、28 d行激光多普勒掃描，觀察小鼠下肢血流灌注情況。

1.3.4 HE染色病理檢測：術(shù)后28 d處死小鼠，取右下肢腓腸肌，放置到4%多聚甲醛中固定，然后依次常規(guī)行脫水包埋、切片烤片、脫蠟、染色(蘇木素-伊紅)、脫水封片等，予以顯微照像，觀察肌肉組織病理。并進行組織病理評價，評定指標包括：肌纖維萎縮是否存在、是否出現(xiàn)變性壞死、是否有炎癥反應(yīng)、是否存在鈣化，按由輕至重分別計為0～4分，評分越高說明病變程度越嚴重。

1.3.5 免疫組化法檢測血管新生：取小鼠右下肢腓腸肌，行免疫組化實驗，進行CD34、α-SMA表達檢測。常規(guī)石蠟切片、脫蠟至水，行抗原修復(fù)，利用5% BSA進行封閉，滴加一抗，于4 ℃條件下孵育過夜，然后再予以二抗滴加，采用DAB顯色，用蘇木精進行復(fù)染，脫水透化，予以封片，顯微照像，并觀察記錄CD34、α-SMA表達。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠下肢缺血癥狀評分比較 觀察發(fā)現(xiàn)，下肢缺血模型建立以后，小鼠右下肢出現(xiàn)無法站立、步態(tài)異常等行為表現(xiàn)。假手術(shù)組右下肢無任何異?，F(xiàn)象，模型對照組與黑參煎劑組右下肢足部出現(xiàn)不同程度發(fā)黑、壞死，其中黑參煎劑組的癥狀優(yōu)于模型對照組。各組小鼠右下肢缺血癥狀評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，模型對照組與黑參煎劑組右下肢缺血癥狀評分均高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示下肢缺血模型構(gòu)建成功。與模型對照組相比，黑參煎劑組下肢缺血癥狀評分低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠右下肢缺血癥狀評分比較(分)

2.2 各組小鼠激光多普勒圖像分析 高脂喂養(yǎng)的黑參煎劑組和模型對照組，右后肢動脈結(jié)扎縮窄手術(shù)結(jié)束即進行多普勒檢測，結(jié)果顯示術(shù)側(cè)基本無血流灌注，對側(cè)血流灌注良好，表明造模成功。術(shù)后即刻、7、14、21、28 d進行激光多普勒檢測，監(jiān)測小鼠右后肢血流變化情況，黑參煎劑組術(shù)后下肢血流恢復(fù)情況優(yōu)于模型對照組(圖1)。

圖1 各組小鼠右后肢激光多普勒掃描圖

2.3 各組小鼠HE染色分析 HE染色光鏡下觀察假手術(shù)組動脈壁三層結(jié)構(gòu)界限清晰，結(jié)構(gòu)完整；黑參煎劑組與模型對照組相比，內(nèi)皮細胞水腫程度、管壁增厚、中性粒細胞浸潤均有所減輕(圖2)。右下肢HE染色病理評分比較，黑參煎劑組與模型對照組的評分均高于假手術(shù)組(P<0.05)；黑參煎劑組右下肢HE染色病理評分低于模型對照組(P<0.05)。

圖2 各組小鼠右下肢動脈病理圖(HE染色，×200)

表2 各組小鼠右下肢HE染色病理評分比較(分)

2.4 各組小鼠右下肢腓腸肌CD34、α-SMA表達比較 見表3。與假手術(shù)組、模型對照組相比，黑參煎劑組的右下肢腓腸肌 CD34、α-SMA表達均高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組小鼠右下肢腓腸肌CD34、α-SMA表達比較

3 討 論

采用下肢股動脈結(jié)扎法構(gòu)建下肢缺血模型，可較好地模擬該類疾病患者下肢缺血的病理改變，呈現(xiàn)下肢缺血發(fā)生、演變及修復(fù)等多個過程[12-15]。本實驗根據(jù)以往研究經(jīng)驗，成功構(gòu)建了小鼠右下肢缺血模型，利用顯微鏡觀察小鼠右下肢缺血癥狀并進行量化積分，結(jié)果顯示，黑參煎劑能夠明顯改善下肢缺血癥狀；激光多普勒圖像分析顯示，黑參煎劑能夠有效促進缺血下肢血流恢復(fù)；同時HE染色結(jié)果表明，黑參煎劑能夠改善下肢缺血組織病理改變，緩解炎癥反應(yīng)。

黑參煎劑中的有效成分主要有皂苷類、多糖類揮發(fā)性油、氨基酸、維生素、微量元素等。已有研究表明[16-17]，皂苷類具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降低血糖等作用，與傳統(tǒng)的白參和紅參相比較，黑參的炮制方法使抗衰老、抗氧化和提高機體免疫力的作用增強[18-21]。前期研究結(jié)果顯示，在腎上腺素加冷刺激導(dǎo)致的急性血瘀的大鼠模型中，黑參可以顯著降低大鼠全血黏度，具有改善血液流變學(xué)的作用，同時能夠抑制血栓形成。本研究表明，黑參煎劑對小鼠下肢缺血具有保護作用，能夠促進血管新生。

CD34+是一種跨膜糖蛋白，作為內(nèi)皮祖細胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)的表面標志物，其水平能夠較好地反映EPCs的數(shù)量[22]。機體出現(xiàn)缺血刺激時，CD34+被動員出骨髓，進而參與到血管新生過程，CD34+抗原在新生的血管內(nèi)皮中大量表達，具有重要標志性意義[23-25]。血管新生過程中，平滑肌細胞大量存在，能夠合成彈性蛋白、膠原等多種物質(zhì)，形成血管基質(zhì)。α-SMA作為一種血管平滑肌細胞表型標志物，在低氧環(huán)境下使血管平滑肌細胞的合成與分泌功能激活，產(chǎn)生許多生長因子，對血管內(nèi)皮與其他細胞活性發(fā)揮保護作用，對缺血血管功能維持及恢復(fù)有著重要意義[26-27]。本研究結(jié)果顯示，黑參煎劑能夠增加小鼠右下肢缺血肌肉CD34、α-SMA表達，改善缺血血管側(cè)支生成，促進血管新生。

綜上所述，黑參煎劑對小鼠下肢缺血具有一定保護作用，能夠改善下肢缺血癥狀，提高CD34、α-SMA表達，促進缺血后血管生成。