尚官紅，王曉麗，劉向哲

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.南陽(yáng)張仲景醫(yī)院，河南 南陽(yáng) 473000；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

缺血性腦血管疾病(Ischemic cerebral vascular disease，ICVD)是臨床常見的由腦血管病變導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cells，ECs)損傷是腦血管疾病發(fā)生的重要機(jī)制之一。內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)主要來源于骨髓，是ECs的前體細(xì)胞，可形成ECs并促進(jìn)血管的形成[3-4]。提高EPCs的增殖及遷移能力，促進(jìn)腦缺血部位的血管再生,是目前的研究重點(diǎn)。

健脾補(bǔ)腎活血方主要由黃芪、黨參、白術(shù)、桑寄生、杜仲、牛膝、丹參、肉蓯蓉、川芎、石菖蒲、甘草組成，具有健脾補(bǔ)腎、活血通絡(luò)作用。方中丹參、黃芪能顯著增加EPCs細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)[5-8]。課題組前期研究結(jié)果表明，健脾補(bǔ)腎活血方能改善缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分，縮小腦梗死的面積，其作用機(jī)制可能與增加外周血中EPCs水平有關(guān)[9]。本實(shí)驗(yàn)以分離出的大鼠骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞(Bone marrow-derived endothelial progenitor cells，BMEPCs)為研究對(duì)象，探討健脾補(bǔ)腎活血方對(duì)大鼠BMEPCs增殖、遷移和黏附能力的影響，為健脾補(bǔ)腎活血方的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級(jí)SD雄性大鼠5只，4～5周齡，平均體重(100±10)g，生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(遼)2015-0001]，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司。大鼠飼養(yǎng)溫度控制在(22±1)℃、濕度45%～55%、光照節(jié)律12 h∶12 h,自由進(jìn)食飲水。

1.1.2 主要儀器：CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)HF-90，上海力申公司)、超凈工作臺(tái)(型號(hào)SW-CJ-2FD，蘇州凈化公司)、酶標(biāo)儀(型號(hào)ELX-800，美國(guó)Biotek公司)、倒置相差顯微鏡(型號(hào)IX53，日本Olympus公司)、顯微鏡拍照系統(tǒng)(型號(hào)DP73，日本Olympus公司)、超速冷凍離心機(jī)(型號(hào)H-2050R，湖南湘儀公司)。

1.1.3 主要試劑：健脾補(bǔ)腎活血方凍干粉(河南省仲景方藥健康衰老產(chǎn)業(yè)工程研究中心實(shí)驗(yàn)室)、大鼠淋巴細(xì)胞分離液(批號(hào)P8630，北京索萊寶科技有限公司)、乙?；兔芏戎鞍?Dil labeled acetylated low-density lipoprotein,Dil-Ac-LDL)(批號(hào)MP6013，上海懋康生物科技有限公司)、荊豆凝集素-1(FITC-labeled ulex europaeus agglutinin 1,FITC-UEA-1)(批號(hào)MP6308，上海懋康生物科技有限公司)、EGM-2MV培養(yǎng)基(批號(hào)CC-3202，美國(guó)Lonza公司)、胎牛血清(批號(hào)SH30084.03，美國(guó)Hyclone公司)、胰酶(批號(hào)T4799，美國(guó)Sigma公司)、MTT(批號(hào)WLA021，沈陽(yáng)萬類生物科技有限公司)、Transwell小室(批號(hào)3422，美國(guó)Corning公司)、多聚甲醛(批號(hào)P6148，美國(guó)Sigma公司)、結(jié)晶紫(批號(hào)0528，美國(guó)Amresco公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠骨髓單核細(xì)胞(Bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)的分離[10]：將5只SD大鼠常規(guī)麻醉消毒，無菌條件下取出四肢長(zhǎng)骨，無菌PBS沖洗，收集骨髓液。將大鼠淋巴細(xì)胞分離液注入離心管中，沿管壁緩慢滴入骨髓液，2000 r/min、室溫、離心20 min，中間的白色云霧層即為單核細(xì)胞，無菌PBS清洗2次，以含有10%胎牛血清的EGM-2MV培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml備用。

1.2.2 大鼠BMEPCs的誘導(dǎo)及培養(yǎng)[11]：取密度為1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種到人血漿纖維連接素包被的T25培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的EGM-2MV培養(yǎng)基，于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2周左右，原代細(xì)胞逐漸融合至80%，調(diào)整細(xì)胞密度，以1∶2或1∶3進(jìn)行傳代。

1.2.3 細(xì)胞活力檢測(cè)：取1滴細(xì)胞懸液與1滴0.2 %臺(tái)盼藍(lán)染液混合，滴在血球計(jì)數(shù)板上，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)并計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 BMEPCs的鑒定：EPCs具有吞噬Dil標(biāo)記的Dil-Ac-LDL和結(jié)合FITC標(biāo)記的FITC-UEA-Ⅰ的功能。BMEPCs培養(yǎng)14 d后進(jìn)行Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色以鑒定分離出的BMEPCs。調(diào)整BMEPCs細(xì)胞密度，加入10 μg/ml的Dil-Ac-LDL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中避光孵育4 h，無菌PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS再次漂洗后，加入80 μg/ml的FITC-UEA-1，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中避光孵育1 h后，熒光顯微鏡下觀察BMEPCs吞噬Dil-Ac-LDL及結(jié)合FITC-UEA-1的情況。

1.2.5 細(xì)胞分組及給藥：細(xì)胞傳代培養(yǎng)14 d后，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMEPCs，以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，正常培養(yǎng)24 h。細(xì)胞饑餓處理后，設(shè)空白對(duì)照組、健脾補(bǔ)腎活血方低劑量組(0.35g/ml)、健脾補(bǔ)腎活血方中劑量組(0.65 g/ml)、健脾補(bǔ)腎活血方高劑量組(1.0 g/ml)，每組5個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 MTT法檢測(cè)BMEPCs增殖：分別予四組細(xì)胞給藥繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入MTT染色液(20 μl/孔)。孵育4 h后，棄去上清，加入150 μl的DMSO溶解細(xì)胞中形成的紫色結(jié)晶。避光反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處OD值。

1.2.7 Transwell檢測(cè)BMEPCs遷移能力：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BMEPCs，用無血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×104個(gè)/50 μl，注入50 μl細(xì)胞懸液于Transwell小室上層，將50 ng/ml的VEGF加入到各組含藥培養(yǎng)基中，并注入Transwell下層。在37 ℃、5% CO2環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)。

1.2.8 BMEPCs黏附能力檢測(cè)：調(diào)整BMEPCs密度至1×104個(gè)/孔，鋪在包被人血漿纖維連接素的96孔培養(yǎng)板上，37 ℃培養(yǎng)1 h。用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定后，1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照并計(jì)算梭形細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1 BMEPCs活力檢測(cè) 結(jié)果顯示著色細(xì)胞數(shù)為(4.00±1.00)個(gè)，未著色細(xì)胞數(shù)為(55.67±7.64)個(gè)，細(xì)胞總數(shù)為(59.67±6.66)個(gè)，BMEPCs活力為93.3 %，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1雙熒光染色鑒定BMEPCs 熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，BMEPCs攝取Dil-Ac-LDL后，細(xì)胞胞漿呈紅色，BMEPCs吞噬FITC-UEA-1后，細(xì)胞胞漿呈綠色，同時(shí)顯示雙熒光陽(yáng)性呈橙色的細(xì)胞為BMEPCs(圖1)。

A：Dil-Ac-LDL；B：FITC-UEA-1；C：Merge

2.3 各組BMEPCs增殖情況比較 見表1。與空白對(duì)照組比較，健脾補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組細(xì)胞的吸光度值均升高，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。健脾補(bǔ)腎活血方低劑量組、健脾補(bǔ)腎活血方中劑量組細(xì)胞的吸光度值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。健脾補(bǔ)腎活血方高劑量組細(xì)胞的吸光度值高于健脾補(bǔ)腎活血方低劑量組、健脾補(bǔ)腎活血方中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 各組BMEPCs增殖情況比較

2.4 各組BMEPCs遷移能力比較 見表2(圖2)。健脾補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)均多于空白對(duì)照組，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。健脾補(bǔ)腎活血方低劑量組、健脾補(bǔ)腎活血方中劑量組細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。健脾補(bǔ)腎活血方高劑量組細(xì)胞的遷移個(gè)數(shù)高于健脾補(bǔ)腎活血方低劑量組、健脾補(bǔ)腎活血方中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表2 各組BMEPCs遷移能力比較(個(gè))

A：空白對(duì)照組；B：健脾補(bǔ)腎活血方低劑量組；C：健脾補(bǔ)腎活血方中劑量組；D：健脾補(bǔ)腎活血方高劑量組

2.5 各組BMEPCs黏附能力比較 見表3(圖3)。健脾補(bǔ)腎活血方低、中、高劑量組細(xì)胞黏附數(shù)均高于空白對(duì)照組，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。健脾補(bǔ)腎活血方低劑量組、健脾補(bǔ)腎活血方中劑量組細(xì)胞黏附數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。健脾補(bǔ)腎活血方高劑量組細(xì)胞黏附數(shù)高于健脾補(bǔ)腎活血方低劑量組、健脾補(bǔ)腎活血方中劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表3 各組BMEPCs黏附能力比較(個(gè) )

A：空白對(duì)照組；B：健脾補(bǔ)腎活血方低劑量組；C：健脾補(bǔ)腎活血方中劑量組；D：健脾補(bǔ)腎活血方高劑量組

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腦組織損傷或缺氧時(shí)，外周血中EPCs增加，并遷移歸巢至腦組織損傷處，形成ECs以促進(jìn)血管的生成。由此可見，恢復(fù)EPCs的增殖遷移能力，促進(jìn)血管新生對(duì)治療ICVD具有重要臨床意義。EPCs來源于骨髓，具有分化ECs的特點(diǎn)，與中醫(yī) “腎主骨生髓” 理論一致[12]。諸多研究表明，補(bǔ)腎益氣中藥可增加EPCs數(shù)量，提高其增殖、遷移及動(dòng)員能力，從而促進(jìn)腦缺血區(qū)血管修復(fù)及再生[13]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯能增加外周血EPCs的增殖、遷移及黏附能力[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血湯通過激活MMP-9信號(hào)通路，使大鼠BMEPCs進(jìn)入外周血循環(huán)，促進(jìn)其遷移至受損血管內(nèi)皮處，修復(fù)受損血管內(nèi)皮細(xì)胞[15]。趙瑞成等[16]發(fā)現(xiàn)，柔肝通絡(luò)湯通過增加腦缺血大鼠EPCs的數(shù)量，促進(jìn)大鼠腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)。綜上可知，采用中醫(yī)藥調(diào)控EPCs細(xì)胞增殖與分化在中醫(yī)理論上具有一定的可行性。

健脾補(bǔ)腎活血方，具有養(yǎng)氣補(bǔ)血、健脾補(bǔ)胃、滋肝補(bǔ)腎的功效[17]。方中黨參、白術(shù)取四君子湯意，健脾益氣；桑寄生、杜仲、牛膝、肉蓯蓉補(bǔ)益肝腎，使元?dú)馔?，腦髓得充；丹參、川芎活血化瘀，與補(bǔ)氣藥配伍相輔相成；少佐石菖蒲開竅化痰，甘草調(diào)和諸藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)腎活血方能促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)[18]。研究發(fā)現(xiàn)黃芪提取物可以提高大鼠EPCs的生物活性，促使其發(fā)生黏附和遷移，促進(jìn)血管新生[19]。丹參的水溶性有效成分可通過增加EPCs數(shù)量，促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)[20]。課題組前期臨床研究表明，健脾補(bǔ)腎活血方能夠改善腦梗死患者臨床癥狀和體征，提高患者日?；顒?dòng)能力，臨床效果較好。由此可見，該方在治療缺血性血管疾病方面具有較好的臨床效果，但其是否能增強(qiáng)EPCs細(xì)胞的增殖動(dòng)員能力尚待研究。鑒于此，本研究通過密度梯度法獲取大鼠骨髓單核細(xì)胞，并將其誘導(dǎo)生成BMEPCs，體外研究健脾補(bǔ)腎活血方對(duì)BMEPCs生物學(xué)功能的影響。結(jié)果顯示，健脾補(bǔ)腎活血方能顯著提高BMEPCs增殖、遷移及黏附能力，其影響B(tài)MEPCs生物學(xué)功能的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。